Laura Campos Diaz: noviembre 2012

martes, 27 de noviembre de 2012

3.5.2.3. Cryoconservacion del germoplasma

La crioconservación, que puede ser aplicada ventajosamente a la conservación de especies y variedades vegetales silvestres o cultivadas como alternativa a las colecciones y bancos de germoplasma clásicos (bancos de semillas, colecciones en campo). La crioconservación de plantas es un proceso consistente en la preparación, mantenimiento y preservación a largo plazo de un material vegetal, en unas condiciones de temperatura ultra bajas de –196 ºC, obtenidas mediante nitrógeno líquido (NL). Este método de conservación de material vegetal presenta una serie de ventajas frente a otros sistemas de preservación de recursos filogenéticos: es un método rápido, sencillo, no altera la estabilidad genética del material y reduce sustancialmente el esfuerzo y los costes que representan el mantenimiento de colecciones de germoplasma vegetal in vivo o in vitro, al eliminar casi por completo la mano de obra y evitar los riesgos fitopatológicos y fisiológicos que habitualmente aparecen en el mantenimiento de los bancos de germoplasma vegetales. Hay que señalar el importante ahorro de espacio que supone mantener una colección de especies hortícolas o leñosas en pocos metros cuadrados en vez de en plantaciones de cientos o miles de metros cuadrados.

El elemento fundamental de la crioconservación es el NL que se almacena y mantiene en tanques especiales herméticos que permiten que se mantenga en estado líquido y se evapore muy lentamente, manteniendo una temperatura de –196 ºC. El NL es incoloro, inodoro y no combustible y está a una temperatura de –196 ºC a presión atmosférica, por lo que el contacto con los tejidos provoca el congelamiento del área. Es de fácil manejo pero, teniendo en cuenta que desplaza el oxígeno del aire, hay que tener cuidado al manipularlo, lo que se debe hacer en lugares bien ventilados.

El material vegetal a utilizar puede proceder de cualquier parte de la planta: meristemos, yemas, ápices, tallos, callos, embriones somáticos, etc. Debe ser seleccionado de plantas sanas y, en el caso de proceder de material de cultivo in vitro, los parámetros de cultivo se deben optimizar antes de la crioconservación, ya que el éxito de éste proceso de conservación va a depender tanto de los tratamientos utilizados antes de someter al material al NL, como de los utilizados una vez recuperado el material del NL. Por lo tanto, es de extrema importancia poner especial atención en la composición de los medios de cultivo donde se incube el material vegetal antes y después de introducirlo en NL para su conservación [Sakai y cols., 1993, Cryopreservation of Plant Genetic Resources 6: 5-26].

3.5.2.2. Supresión del crecimiento

Existen riesgos de inestabilidad citogenética cuando se conserva el germoplasma mediante el cultivo de tejidos in vitro a largo plazo. Este riesgo se puede minimizar utilizando tejidos organizados (meristemos, yemas y cultivos derivados) y reduciendo la tasa de crecimiento mediante la temperatura baja. Con forme se reduce la temperatura de un tejido, el metabolismo celular disminuye hasta llegar a un estado de suspensión animada cuando la temperatura alcanza niveles inferiores a -150 °C; a esta temperatura, los procesos biológicos han cesado y las posibles causas de inestabilidad se habrán, por tanto, minimizado o eliminado

3.5.2.1. Factores que limitan el crecimiento

El cultivo in vitro de plantas superiores es una técnica que exige un control absoluto del ambiente tanto físico como químico, en el que se sitúa al explante. Los principales factores no biológicos que afectaran al desarrollo del cultivo in vitro como:

Ambiente químico: composición del medio y pH.

Ambiente físico: temperatura, luz y fotoperiodo

Banco genético activo (Limitación del crecimiento):

Temperatura

Nutrientes (orgánicos e inorgánicos)

Reguladores de crecimiento

Concentración osmótica

3.5.2. Métodos de conservación

La conservación puede aplicarse en teoría a tres niveles de organización: génica, de organismo y Ecológica. Con el avance de las técnicas de ingeniería genética, es posible que en el futuro lleguen a establecerse bancos de ADN; sin embargo, por el momento los genes se conservan agrupados en individuos o en ecosistemas.

Los métodos de conservación de recursos filogenéticos pueden clasificarse de esta forma en dos grandes categorías: métodos de conservación ex situ y métodos de conservación in situ. Estos últimos consisten en preservar las variedades o poblaciones vegetales en sus hábitats originales, mientras que en los primeros la conservación se realiza en los denominados bancos de germoplasma.

Conservación en campo:

La conservación mediante colecciones de plantas mantenidas en el campo se realiza fundamentalmente en especies sexualmente estériles o que poseen semillas que no pueden ser conservadas durante largos periodos de tiempo. Se emplea también en especies de reproducción vegetativa para el mantenimiento de clones y en aquellas que tardan mucho en producir semilla, como es el caso de las forestales. Entre los cultivos que se conservan en colecciones de este tipo se encuentran algunos de tanta importancia como la patata, la mandioca, el ñame, la batata, el plátano y los árboles frutales en general. Las colecciones de plantas se mantienen en el campo, regenerándolas periódicamente a intervalos que dependen de la duración del ciclo de la planta. Este tipo de conservación necesita grandes extensiones de superficie, especialmente cuando se trata de árboles, y requiere un coste de mantenimiento elevado sobre todo si las plantas necesitan regeneraciones anuales o muy frecuentes. El riesgo de pérdidas por ataque de plagas y enfermedades, anomalías climáticas u otros accidentes naturales es también mayor que en otros tipos de conservación.

Conservación de semillas:

Este método de conservación es actualmente el más utilizado en los bancos de germoplasma, Resultando el más eficiente, económico y seguro para la conservación ex situ de la mayoría de las especies de las zonas templadas, cuyas semillas son capaces de permanecer viables largo tiempo bajo determinadas condiciones (semillas “ortodoxas”). La longevidad de las semillas ortodoxas puede aumentarse extraordinariamente disminuyendo su contenido de humedad y la temperatura de almacenaje. Según las reglas empíricas de Harrington (1965), la vida de la semilla se duplica por cada 5ºC de disminución de temperatura y por cada 1% de reducción de su contenido en humedad, siendo ambos efectos aditivos. La disminución simultánea de estos dos factores permitiría, al menos teóricamente, mantener durante cientos de años la viabilidad de las

3.5.1.4. Estrategias

Los métodos de conservación in vitro son importantes para especies que se propagan en forma agámica, para especies que poseen genotipos altamente heterocigotas como así también para especies que producen semillas recalcitrantes. Por ende, constituyen complementos importantes para los bancos de semillas y las colecciones a campo. Si bien este método ofrece la posibilidad de conservar germoplasma a corto y mediano plazo en un espacio más reducido y a menor costo en relación con las colecciones a campo, existe el riesgo de pérdida de las entradas por contaminación accidental, error humano y /o por variación somaclonal y los costos de las labores por mantenimiento son altos.

La crioconservación, es decir el almacenamiento de material biológico a temperatura ultra baja, generalmente la del nitrógeno líquido (-196ºC), es la única técnica actualmente disponible que asegura la conservación a largo plazo del germoplasma vegetal. A esta temperatura, las divisiones celulares y los procesos metabólicos se encuentran detenidos, por lo que el material vegetal puede ser almacenado sin alteración o modificación por un período de tiempo teóricamente ilimitado. Más aún, el material crioconservado requiere un mínimo mantenimiento, un espacio reducido y no existen riesgos de contaminaciones

3.5.1.3. Estabilidad genética

La estabilidad genética de los cultivos ha sido, durante mucho tiempo, un motivo de inquietud cuando se piensa aplicar las técnicas in vitro para la conservación del germoplasma.

Los sistemas de cultivo de tejidos presentan diferentes niveles de riesgo de variación genética. Igualmente, entre las dos estrategias de conservación in vitro –el crecimiento lento y la crioconservación- hay posibilidades de variación debidas a la posible regeneración de yemas adventicias.

3.5.1.2. Variabilidad

La evaluación de la viabilidad de los cultivos in vitro se debe realizar sistemáticamente. Las características más importantes que se evalúan en el almacenamiento de crecimiento lento de cultivos derivados del ápice de yemas son: contaminación, senescencia de la hoja (la razón hojas verdes/hojas muertas), número de brotes verdes (para micropropagación adicional), número de nudos viables (verdes) en relación con la longitud del tallo (verde), presencia o ausencia de raíces, y ocurrencia de callo.

3.5.1.1. Regeneración

La regeneración viene marcada por la necesidad de rejuvenecimiento de las muestras almacenadas, las cuales pueden alterar sus características genéticas al envejecer. La multiplicación es necesaria cuando es preciso aumentar el tamaño de muestra para llegar a los mínimos de conservación recomendados o para disponer de reservas suficientes para suministrar a los usuarios. Ambas operaciones constituyen un mismo proceso aunque en cada caso puede variar la cantidad de material a obtener. La regeneración o multiplicación en campo son actividades costosas y delicadas en las que la diversidad resulta especialmente vulnerable. Su principio primordial debe ser no alterar la composición genética del material vegetal, lo cual implica controlar procesos a veces muy complejos cuando las entradas son poblaciones heterogéneas. En estos casos, es necesario evitar una pérdida selectiva de genotipos a lo largo de todo el ciclo de cultivo, para lo cual es fundamental que el ambiente del lugar de multiplicación sea lo más semejante posible al de origen. El tamaño de la muestra debe ser suficiente para minimizar el riesgo de pérdida de alelos al azar (deriva genética) que se acentúa cuando las poblaciones son pequeñas. Además, en especies alogamas, es preciso utilizar métodos de aislamiento que eviten contaminaciones por polen extraño y no impidan la polinización natural, lo cual que resulta muy costoso cuando hay que multiplicar simultáneamente un número elevado de muestras (Breese, 1989). Los procesos de regeneración y multiplicación deben por tanto realizarse con la menor frecuencia posible y en casos especialmente problemáticos, como es el de las especies silvestres, puede ser más aconsejable realizar una nueva recolección cuando esto que sea posible

La regeneración del plantas enteras basadas en los sistemas de cultivo de células es, a menudo, el paso que limita la aplicación de técnicas de cultivo in vitro a especies vegetales que no se pueden propagar mediante meristemos preformados. A pesar de la capacidad que tienen para iniciar callo diversos tejidos y órganos de muchas especies cultivadas, la regeneración reproducible de plantas enteras sigue siendo problemática. La regeneración adventicia mediante la embriogénesis somática es muy deseable, ya que el proceso ofrece altas tasas de multiplicación y produce propágalos que poseen ejes de raíz y de yema. Los embriones somáticos pueden desarrollarse de células únicas y se pueden recuperar plantas con genotipos más estables.

3.5.1. Aspectos importantes en la conservación in Vitro

actualmente, el cultivo in vitro de tejidos vegetales es considerado una herramienta fundamental en el desarrollo agrícola y en la conservación de plantas de importancia económica y/o ecológica, debido a que proporciona alternativas para la solución de problemas presentados en los programas de propagación de plantas, donde los métodos tradicionales hasn resultado ser poco eficaces en algunos casos.

A. Permite obtener plantas libres de enfermedades.

B. La micro propagación vegetal nos permite propagar masivamente material vegetal en cualquier época del año y en corto tiempo conservando su potencial genético y calidad sanitaria.

C. Permite optimizar el uso de factores ambientales y nutricionales.

D. Facilita el cultivo de ungran numero de plantas en una superficie pequeña

E. Puede conservar material biológico por periodos de tiempo prolongados.

F. Además mediante este método de propagación se puede incluir aspectos de fitomejoramiento.

3.5 Conservación In Vitro

Existen variadas estrategias de conservación de recursos fitogenéticos, las cuales dependen del tipo de germoplasma y de los objetivos de la conservación. En el caso de especies que desarrollan semillas de tipo ortodoxas (cereales, leguminosas, oleaginosas, forrajeras) el sistema de conservación recomendable son los bancos de germoplasma, sin embargo existe un número importante de especies que se caracterizan por no producir semilla botánica, teniendo como alternativa de reproducción órganos vegetativos, como tubérculos, rizomas, bulbos etc. Para este grupo la conservación de germoplasma en campo es una alternativa, pero ofrece dificultades de manejo y riesgo de pérdida por condiciones climáticas adversas o catástrofes naturales. En este caso las técnicas recomendables son el cultivo in vitro y la criopreservación.

La criopreservación, otra técnica de laboratorio, se basa en la reducción y detención de las funciones metabólicas de los materiales biológicos a temperatura del nitrógeno líquido, es decir a -196 ºC, manteniendo por periodos indefinidos, la viabilidad de los materiales conservados.
El cultivo in vitro es un método de propagación de plantas de aplicación profesional, puesto que se realiza en laboratorio, en unas condiciones estériles y con unas instalaciones especiales. Lo fundamental es que se hace en unas condiciones muy controladas y totalmente estériles: utensilios, cámara de manipulación, etc., todo está desinfectado en autoclave. La planta ya desarrollada en el cultivo in vitro necesita una primera aclimatación en el laboratorio; en el invernadero y después una segunda aclimatación en el campo. Los viveros grandes realizan ambas operaciones; otros sólo se encargan del primer paso.

3.4.4. Aplicación agronomica

La población de células resultantes de estos procesos de fusión va a ser una mezcla de protoplastos parentales, homocariontes y heterocariontes con dos o mas núcleos.
Para seleccionar los productos de fusión de interés, es necesario utilizar medios restrictivos para células no híbridas, o que produzcan una proliferación diferencial para las células híbridas y/o incorporar un sistema de marcaje que permita reconocer y seleccionar los productos híbridos. Un tipo de selección clásico es el basado en la complementación de mutantes no alélicos (por ejemplo la combinación de dos mutaciones recesivas albinas no alélicas que permiten la detección de los híbridos simplemente por su color; Melchers y Labib, 1974), existiendo otros muchos métodos de selección (incorporación de mutaciones de deficiencia, de resistencia, etc.) y tambien métodos de verificación del caracter híbrido en plántulas regeneradas, como el examen de los patrones morfológicos y/o isoenzimáticos.
Debemos señalar que una vez obtenidos híbridos somáticos interespecíficos por fusión de protoplastos y regeneración de los productos seleccionados, estos híbridos van a ser distintos a los híbridos obtenidos sexualmente.

Las plántulas obtenidas por fusión somática, pueden ser a nivel nuclear de varios tipos:

a) Híbridos somáticos típicos;

b) Poliploides;

c) Aneuploides s (híbridos asimétricos;

d) Híbridos con el contenido nuclear de un parental y fracciones de información genética del otro parental (de uno a miles de genes).

A nivel citoplásmico las plantas híbridas pueden presentar:

a) La suma de los citoplasmas de ambos parentales;

b) El citoplasma de un solo parental;

c) Un citoplasma híbrido resultado de la recombinación de los genomas extranucleares de ambas células.

Por ello el conjunto de combinaciones nucleares y citoplásmicas conforma un enorme número de posibilidades teóricas.
La fusión de células somáticas puede aplicarse para

1) La superación de la incompatibilidad en cruces interespecíficos;

2) Un mejor aprovechamiento de la variación intraespecífica y extraespecífica en cruces interespecíficos compatibles, al ser los híbridos somáticos distintos y superiores a los sexuales, posiblemente por la combinación de genomas extranucleares (Moreno, 1984); 3)

La obtención de híbridos citoplasmáticos o cíbridos, al transferirse genes extracromosómicos, que confieren características especiales al híbrido (ej. androesterilidad citoplásmica).
Aunque la fusión de protoplastos ha sido utilizada con éxito para solventar problemas de incompatibilidad entre especies con los que tropezaba la mejora genética tradicional, y ha permitido obtener híbridos somáticos interespecíficos e intergenéricos, con especiales combinaciones genéticas nucleares y citoplásmicas, quizá la aplicación mas interesante de la fusión somática sea la transferencia de una cantidad limitada de información genética de una especie a otra, de forma poco controlada. Así, mediante tratamientos físico-químicos es posible inactivar o destruir total o parcialmente los núcleos de las células parentales, con lo que solo una parte desconocida de la información genética va a ser transferida al híbrido, que suele ser estéril. En determinados casos es posible mediante sucesivas retrofusiones eliminar casi todo el genoma de uno de los parentales (ej. el híbrido resistente a atrazina entre Solanum nigrum y Lycopersicon esculentum; Jain et al., 1988). Otro caso modelo de cibridación es el Brassica-Raphanus (Pelletier et al., 1983): el heterocarionte contiene el núcleo de Brassica napus, los cloroplastos resistentes a atrazina de Brassica campestris y las mitocondrias de Raphanus sativa que confieren androesterilidad.
Para asegurar el desarrollo de estos nuevos productos, estos suelen integrarse en programas clásicos de mejora, pero para ello necesitan cumplir dos condiciones (lo mismo que los híbridos sexuales convencionales): uno, deben ser al menos parcialmente fértiles para permitir retrocruzamientos (híbridos somáticos tetraploides); y dos, en los retrocruzamientos se deben transferir solo un pequeño número de genes, ya que los caracteres multigénicos son incontrolables.
Todos estos métodos se encuentran aún en fase experimental, limitados por el reducido número de especies a las que es posible aplicarlos por cuestiones técnicas y por lo poco controlable que es la transferencia de material genético, ademas en clara competencia con otros métodos de transformación genética (Agrobacterium, ...), tal vez técnicamente más sencillos, rápidos y dirigibles, que a pesar de todo no invalidan el método de fusión de protoplastos para la obtención de nuevos productos para la mejora vegetal.

Los cultivos de suspensiones vegetales tienen un amplio rango de aplicaciones constituyendo una técnica muy valiosa en los estudios sobre:

1) la regulación del ciclo celular,

2) la replicación del ADN y la síntesis de proteínas

3) la transferencia de material genético,

4) la absorción y transporte de nutrientes, 5) los diferentes eventos metabólicos,

6) la producción de metabolitos de interés en las industrias alimenticias, de fragancias y farmacéuticas,

7) el aislamiento y la selección de mutantes, 8) los procesos de diferenciación y desarrollo de los embriones resultantes de la embriogénesis somática,

3.4.3. Fusión de protoplastos

La fusión de protoplastos es una técnica de biotecnología en la cual se produce la fusión de las membranas de dos o más células dando lugar a un híbrido somático. La técnica es ampliamente empleada para introducir variabilidad en las cepas de interés biotecnológico. Típicamente se realiza mediante protoplastos vegetales, esto es, células vegetales desprovistas de pared celular, si bien también puede efectuarse empleando otros taxones, como algunos hongos.^[]

En biotecnología vegetal, la fusión de protoplastos se emplea en programas de mejora; un ejemplo es la generación de poliploides, generalmente más productivos. Para ello la metodología consiste en aplicar pulsos eléctricos a células en suspensión (electroporación) o inducir la desorganización de las membranas empleando polietilenglicol. Esta técnica, pese a mezclar el contenido genético de dos líneas distintas, no está considerada ingeniería genética, pues en su ejecución no se emplea la tecnología del ADN recombinante.^[]

La técnica de fusión de protoplastos surge como especialidad o aplicación a partir de las técnicas de aislamiento y cultivo de protoplastos, que permiten la obtención de células desprovistas de pared celular gracias a la acción de enzimas líticos (celulasas, pectinasas) obtenidos de microorganismos (Aspergillus sp.; Trichoderma viride; Rhizopus sp.), y su posterior crecimiento (división celular, formación de microcallos y regeneración de plántulas por vía organogénica o embriogénica).
Aunque circunstancialmente ocurren fusiones espóntaneas entre protoplastos, y en este hecho se encuentra el origen de esta técnica, es necesario aumentar la eficacia del proceso y «dirigirlo» mediante sistemas de inducción adecuados. Los procesos de inducción son de dos tipos: Químicos, en ellos se usan sustancias aglutinantes como el polietilenglicol (PEG) o el dimetilsulfóxido (DMSO) y, Físicos, como la electrofusión, que consiste en la inducción de una dipolarización de los protoplastos mediante corrientes alternas de alta frecuencia, que van a hacer contactar y alinearse a los protoplastos siguiendo las líneas del campo eléctrico generado, y en ese momento con un pulso de corriente continua se consigue la fusión de las células.

4.3.2 Variación somaclonal

La variación somaclonal es la variación genética o epi genética que se genera durante el cultivo in vitro de plantas (cultivos celulares de tejidos u órganos) que provenga de células somáticas. En programas de mejoramiento genético, la variación somaclonal puede constituirse en un recurso importante que genera variabilidad. Sin embargo, durante la micropropagación y en bancos de germoplasma in vitro, este tipo de variación es indeseable. En vista de lo anterior, se han utilizado una serie de técnicas moleculares para su detección

El cultivo in vitro puede ser células vegetales un ambiente muy estresante e involucra procesos mutagénicos durante el establecimiento del explante, la inducción de callo, la formación de embriones y la regeneración de plantas. Por esta vía es posible obtener variación, de origen nuclear y/o citoplasmática, que podría ser utilizada para el mejoramiento vegetal. Este proceso, se denomina Variación Somaclonal, involucra cambios en las plantas regeneradas que son transmitidos a la progenie.

Entre las causas que original la variación somaclonal se encuentran alteraciones en el cariotipo, mutaciones puntuales, recombinación somática e intercambio de cromátidas hermanas, rearreglos génicos somáticos, elementos genéticos transponibles, amplificación y/o metilación del ADN y cambios en el ADN de los orgánelos (mitocondrias y cloroplastos).

Factores relacionados con la aparición de variación somaclonal

· Genotipo → En general se asume que la frecuencia de cambios dependerá de variaciones preexistentes en el genotipo y de las interacciones que surgen entre el genotipo y el proceso de cultivo.

· Explante → Se puede dar como consecuencia de quimerismo Si estos tejidos se utilizan como explantes y sus células son inducidas a dividirse y rediferenciarse, las diferentes líneas celulares podrían entonces dar origen a plantas genéticamente diferentes.

· Fase de callo → La iniciación de un callo puede ser análoga a la respuesta de las plantas a heridas, que se sabe que activan elementos transponibles y estimulan la inducción de enzimas y productos específicos que se inducen también en situaciones de estrés. Cuando comienza la división celular a partir de tejidos diferenciados, que dará origen a un callo, se incrementa el riesgo de inestabilidad cromosómica. La variación que ocurre en los números cromosómicos en la primera fase de la inducción del callo sería el resultado de fragmentación nuclear seguida por mitosis de los fragmentos nucleares, combinada con la mitosis normal de los núcleos intactos (núcleos euploides).

· Vía de regeneración → La variación observada en cultivos embriogénicos es relativamente menor que la que aparece en cultivos organogénicos. Esto probablemente se debe a la gran presión de selección impuesta en la formación de los embriones, mayor que la requerida en la formación de vástagos. El gran número de genes requeridos para la iniciación y maduración de embriones cigóticos y somáticos impediría la acumulación de mutaciones deletéreas.

· Naturaleza del callo → Un callo verdadero es una masa de células desdiferenciadas que proliferan Desorganizadamente, lo cual probablemente genera considerable variación.

· Medio de cultivo → Un mismo explanto puede tener diferente comportamiento si se lo cultiva en medio sólido o en medio líquido. Otro factor importante es la temperatura, que puede inducir inestabilidad cariotípica o puede incrementar el número de plantas albinas.

· Reguladores de crecimiento → El 2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético) ejercen profundos efectos sobre la respiración celular, el consumo de azúcares y en el control de la división celular.Por ello se especula acerca de su rol indirecto en la inducción de cambios en el metabolismo celular y tisular de plantas creciendo in vitro. La auxina:citocinina, produce fragmentación nuclear amitótica y se le reconoce como causa de aneuploidía. El 2,4-D, el AIA (ácido indolacético) y el ANA (ácido naftalenacético) han sido señalados como los responsables de los incrementos en la metilación de la citosina que tiene lugar durante el cultivo in vitro.

· Deficiencia de oxígeno → La tensión de oxígeno de las células en la superficie del callo es diferente a la de aquellas células que se encuentran situadas profundamente en la masa del mismo. La anaerobiosis resultaría en la producción de etanol, el cual podría comportarse como un mutágeno.

· Acumulación de metabolitos → Las condiciones de cultivo in vitro podrían afectar los niveles de resistencia celular al efecto de los metabolitos que normalmente se encuentran presentes en los tejidos en bajas concentraciones.

· Edad del cultivo → En los períodos prolongados de cultivo hay una pérdida de totipotencia y que esto sucedería debido a la acumulación de mutaciones y a la alteración de los genes que son responsables de la regeneración.

· Deficiencia o exceso de minerales → Las deficiencias o excesos de azufre, fósforo, nitrógeno, calcio y magnesio pueden resultar en cambios genómicos.

Desventajas de la Variación Somaclonal

Ø En algunos casos, las variantes somaclonales no han avanzado de la etapa de laboratorio o invernáculo, probablemente debido a que el material seleccionado tiene poca importancia práctica.

Ø La escasa regeneración de plantas en cultivos de largo término. Generalmente en estos casos existe pérdida de la capacidad morfogénica.

Ø La regeneración está limitada a genotipos específicos que pueden no ser de mucho interés para los mejoradores.

Ø Algunos somaclones son inestables (originados por variación epigenética).

Ø Algunos presentan alteraciones no deseables como aneuploidía, esterilidad, etc.

3.4.1. Producción de haploides: cultivo de anteras y óvulos

Esta técnica es especial para mejoramiento genético. Las células de las plantas posees paredes de celulosa las cuales se pegan entre si debido a la pectina. El tratamiento enzimático de células y pectinasa divide a las células en unidades individuales (protoplastos). Se se cultivan los protoplastos , se pueden obtener series de complejos que han proliferado a partir de una celula madre.

Mediante esta técnica, las anteras inmaduras que contienen polen en una etapa específica de desarrollo se colocan en medios donde el polen inmaduro se divide para formar embriones o callo. Transferidos éstos a medios de regeneración, se forman plantas. En la mayoría de los casos se producen plantas haploides estériles, pero en algunas especies ocurre una duplicación espontánea de los cromosomas en las etapas de desarrollo del callo y de regeneración de la planta

El cultivo de anteras aplicado al fitomejoramiento

El potencial que posee el cultivo de anteras surge de la constitución genética de las células del polen. Las células del polen de los híbridos F₁ contienen la dotación genética de las plantas paternas y las recombinaciones esperadas según las proporciones mendelianas. Estas células son haploides y permiten por ello al mejorador selecciones eficazmente los recombinantes deseables; además, una vez duplicadas esas células, se establecen rápidamente líneas homocigóticas.

Ventajas del cultivo de anteras:

A) Obtención de haploides duplicados a partir de híbridos F₁ puede ser útil para desarrollar variedades en forma fija en una estación central, con el fin de distribuirlas en ambientes ecológicos muy diversos y de ensayarlas en ellos.

B) Crear y acrecentar reservas citogenéticas y citoplasmáticas de los principales cultivos.

C) Etc

Cultivo de óvulos

El cultivo de óvulos se ha usado para rescatar embriones derivados de cruzamientos interespecíficos. Ha sido útil también para rescatar híbridos intergenéricos, y para rescatar embriones abortados en uvas sin semillas.

Factores que afectan el cultivo

Placenta: la velocidad del desarrollo embrionario en los cultivos de óvulos se puede aumentar, algunas veces, por medio del cultivo de óvulos con la placenta todavía adherida a ellos

3.4. Técnicas in Vitro aplicadas al fitomejoramiento

esta técnica se utiliza especialmente para inducir plantas Haploides, las células haploides tienen la mitad de cromosomas de una planta normal. El reactivo que se utiliza para doblar la cantidad de cromosomas se llama colchicina, el cual despues de aplicarlo provoca que la planta posea los pares de cromosomas completos. Esos materiales son homocigóticos (línea pura), por consiguiente, si algunos poseen un carácter deseable, son utiles para cruzamientos

3.3.7 aplicación agronómica

Con la microinjertacion se obtienen de forma eficaz plantas libres de patógenos, libres de virus
Este método resulta ser muy útil en técnicas de fitomejoramiento
intercambio y almacenamiento de germoplasma
transferencias de genes
posibilidad de separar e identificar los patógenos y sus razas que se encuentran en una misma planta
cultivos de importacia económica

3.3. 6 factores que ayudan a incrementarla posibilidad de obtener plantas libres de patógenos

Actualmente la alternativa de más éxito es el cultivo de meristemas apicales, frecuentemente combinado con quimioterapia o con tratamientos de calor. Cuando estos métodos son usados, las plantas no solo son liberadas del virus,sino también de hongos y otros patógenos. El primer cultivo con resultados satisfactorios fue el de Morel y Martín (1952), quienes cultivaron ápices de dalias infectadas con virus y lograron obtener plantas sana. Morel (1955) realizó un cultivo meristemático con Cymbidium, Cattleya y Phajus, obteniendo orquídeas libres de virus, y en 1960 reporta que es necesario hacer ciertas modificaciones en el medio, ya que géneros como Vlanda y Phalaenosis no responden favorablemente (citado por Lecoufle, 1969). Existen otras investigaciones en plantas ornamentales, pero solo se han mencionado las más importantes, por los aportes que han brindado en este campo. En cuanto a especies hortícolas y frutales se han realizado importantes investigaciones en relación con la obtención de material sano a partir de meristemos apicales; los más relevantes fueron hechos en papa

El cultivo de las plantas infectadas a temperaturas altas dificulta la replicación y movimiento de los patógenos termosensibles, por lo que se facilita su eliminación. Temperaturas de 30-32∞C durante 2-3 semanas pueden ser suficientes para incrementar de forma muy importante la incidencia de eliminación de algunos patógenos, e incluso tratamientos de termoterapia seguidos de cultivo o microinjerto de ápices se utilizan rutinariamente en algunos programas.

El tamaño del ápice juega un papel importante en la eliminación de pató-genos. El aumento de tamaño incrementa el porcentaje de regeneración y de prendimiento, pero reduce la proporción de plantas sanas obtenidas. En consecuencia, es necesario en cada caso adoptar una solución de compromiso que permita obtener unos resultados aceptables en ambos parámetros El costo, el tiempo requerido y la dificultad de las técnicas de cultivo in vitro y de diagnóstico de patógenos son los aspectos que deben considerarse para la decisión del tamaño de ápice a utilizar en los programas rutinarios. Por ejemplo, para el saneamiento de cítricos por microinjerto se recomienda la utilización de un ápice compuesto por el meristemo apical y tres primordios foliares, con una longitud de 0'1 a 0'2 mm. Con este tamaño se puede obtener alrededor de un 50% de prendimiento y más del 90% de eliminación de patógenos.

3.3.4 cultivo de embriones

Esta técnica ayuda al cruzamiento intergenetico generalmente, en este cruzamiento, aparece un desarrollo anormal del polen en el pistilo. Si se logra desarrollar el polen, aunque se interrumpa el desarrollo normal algunas veces se puede estimular el crecimiento por el corte del pistilo para el cruzamiento. Si no se cruza el embrión con el polen, no hay oportunidad de cruzamiento. Pero entre materiales intergeneticos, aunque se cruze no se llegaría a la formación de la semilla. El cultivo de esos embriones cruzados (proembriones) resolvería el problema que presenta esa dificultad la etapa adecuada del embrión para cultivar depende de la variedad. Recientemente esta técnica se ha desarrollado y a reportado condiciones especificas para cultivar embriones sin cruzarlos ese órgano proporciona una nueva altermativa para obtener plantas aploides.

3.3.3 cultivos de ápices meristematicos

La regeneración de plantas sanas partiendo de cultivos in vitro de ápices meristemático de ciertos vegetales exige la búsqueda de técnicas complejas y su empleo acertado. Estas técnicas permiten al explante sortear frecuentes dificultades como la oxidación, la heterogeneidad de respuestas, la reversión al estado juvenil, la presencia de inhibidores de enraizamiento y sobre todo la sobrevivencia al trasplante en condiciones autótrofas. Buscando la mejor respuesta del ápice meristemático de algunos plantas Murashige et al. (1972) y Navarro et al. (1975) plantearon la posibilidad del microinjerto in vitro de ápices sobre plántulas provenientes de semillas, logrando así el desarrollo de plantas libres de numerosos virus. Una técnica denominada “microinjerto in vivo” de ápices meristemático pretratados in vitro, fue propuesta por Mosella et al. (1980), con esta técnica se lograron obtener plantas sanas de Prunus pérsica L. Batsch y son menos complicaciones que con la técnica original in vitro. En 1983, Ascui aplico estos nuevos procedimientos a diversos cítricos y obtuvo resultados promisorios que esperan los indizajes virológicos correspondientes.

Para la obtención de ápices meristemático

El ápice meristemático mide de 0.2 a 0.4 mm en cítricos [(Citrus sinensis L) Osbeck cv. Thomson y (Citrus limón L) Burm f. cvs. Genova, Eureka y Lisboa] y de 0.6 a 1 mm en el duraznero (P. pérsica cv. GF 305); comprende el meristema propiamente dicho y uno o dos primordios foliares. El meristemo se obtiene de los brotes terminales de plantas mantenidas en el invernadero o de plantas cultivadas de 2 a 3 años en el campo, si se trata de cítricos. Los brotes se esterilizan superficialmente con etanol 80% (v/v) durante 2 a 3 min y luego durante 10 a 15 min con hipoclorito de calcio (6% - 9%) que contenga 0.1% de Tween-20. Luego los brotes se lavan con agua destilada tres o mas veces. La operación se realiza con ayuda de un binocular de 20 aumentos en una cámara de flujo laminar.

3.3.2 cultivos de meristemos apicales

PRODUCCIÓN DE PAPA LIBRE DE VIRUS

En el caso de papa, como en todas las especies de propagación agámica, los virus tienen una particular importancia por su acumulación en los materiales de propagación y su incidencia en los rendimientos. Se citan en esta especie más de 20 virus que afectan el cultivo, pero solo 3 ó 4 son de significativa importancia en la

Argentina (PVY, PLRV, PVX y PVS).

La única herramienta disponible actualmente para obtener plantas libres de virus de manera eficiente y confiable, es utilizando las técnicas de cultivo de tejidos in vitro.

DESCRIPCIÓN Y REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA

Luego de cosechados y suberificados, los tubérculos seleccionados de los cuales se desea extraer meristemas son sometidos a tratamiento para romper dormición en el caso de que sea necesario.

Luego de transcurridos 15 días en una cámara de brotación a 20 °C aproximadamente, los tubérculos desarrollan brotes de 1 cm. de longitud. En este momento se procede a cortarlos. Inmediatamente se los desinfecta sumergiéndolos unos segundos en alcohol y luego en hipoclorito de sodio al 2% durante 10 – 15 minutos. El recipiente que contiene estos brotes es introducido bajo cámara de flujo laminar ya acondicionada para trabajar. Una vez transcurrido el tiempo de desinfección los brotes son lavados por lo menos 3 veces con agua destilada estéril para eliminar los restos de hipoclorito y colocados en una caja de Petri también estéril.

De aquí se van tomando los brotes para realizar la extracción de los meristemas. El trabajo se realiza bajo el campo visual de una lupa binocular con luz puntiforme, utilizando herramientas tales como bisturíes, pinzas y

microcuchillas.

1. Extracción del meristema

Sobre papel estéril y con ayuda de una pinza que sostiene la base del brote se procede a cortar con un bisturí

las hojas y primordios exteriores, cuidando de no dañar el meristema apical y dejándolo limpio de tejidos adyacentes.

Una vez descubierto el domo se lo extrae con 1-2 primordios foliares utilizando una microcuchilla. Por lo general, el corte se realiza perpendicular al eje del meristema entre 0.1 y 0.2 mm por debajo de la superficie del domo. El explanto adherido a la microcuchilla es transferido a un tubo con medio de cultivo. Es conveniente depositarlo con el ápice hacia arriba para facilitar el crecimiento armónico del tejido.

Inmediatamente después se tapa el tubo con polietileno termocontráctil que permite el intercambio gaseoso con el ambiente.

2. Incubación

Los tubos sembrados se incuban en cámara de cría a 25 ± 2 °C con 70% de Humedad Relativa. La luz es suministrada con tubos fluorescentes usándose una intensidad de 2000 lux y un fotoperíodo de 16 horas.

3. Desarrollo del cultivo

En el transcurso del proceso de desarrollo se pueden realizar 3-4 repiques o subcultivos de los explantos en el mismo medio, con una frecuencia variable entre 1 y 2 semanas. Se efectúan lecturas periódicas para observar el desarrollo y descartar tubos contaminados y meristemas muertos o que al cabo de cierto tiempo no hayan experimentado ningún crecimiento. A los 75-80 días se obtienen las primeras plántulas completas. Estos explantos, que por lo general poseen 4-5 nudos, son micropropagados en un medio adecuado.

4. Evaluación de sanidad: método de detección de virosis de papa

Con 1 ó 2 de las plantas obtenidas en estas primeras micropropagaciones se inicia el control sanitario mediante la aplicación del test ELISA, hospedantes diferenciales y, eventualmente, microscopía electrónica para detectar PLRV, PVY, PVX y PVS. Los mericlones que dan reacción negativa en estas pruebas se continúan multiplicando “in vitro”, realizándose por lo menos 2 o 3 controles más sobre los mismos.

Por otro lado, algunas microplantas de estos materiales son transferidas a tierra con el fin de que desarrollen plantas de mayor porte con lo que se facilita la multiplicación de eventuales partículas de virus remanentes que no fueron detectadas en el material in vitro. De esta forma quedarán en evidencia al realizarse nuevos controles.

Los controles de sanidad se llevan a cabo durante por lo menos un año antes de destinar los materiales definitivamente libres de virus a la multiplicación masiva para su utilización en la producción de minitubérculos.

3.3.1 descripción e importancia

Las plantas tienen la propiedad del crecimiento abierto, que resulta de la presencia de zonas de tejido embrionario, los meristemos, en los cuales la formación de nuevas células continúa mientras otras partes llegan a la madurez. El término meristemo apical alude al conjunto de células cuyas divisiones agregan nuevos elementos al tallo (meristemo apical del tallo) o a la raíz (meristemo apical de la raíz).

El meristemo apical del tallo en Angiospermas está compuesto por el corpus, conjunto de células iniciales y derivadas inmediatas que se dividen en varios planos, y por la túnica, constituida por una o dos capas de células que se dividen anticlinalmente, ubicadas sobre el corpus.

Además de las que ocurren en el meristemo, aún hay divisiones en las regiones subyacentes al mismo que también contribuyen al crecimiento del tallo. Esta porción terminal del ápice es la que se utiliza normalmente para regenerar plantas libres de virus, mediante su cultivo in vitro, en medios adecuados. De tal manera se denomina “cultivo de meristemos” a la siembra del conjunto formado por el verdadero meristemo más la región adyacente que incluye a uno o dos primordios foliares. Una ventaja que esta técnica ofrece es que las células constituyentes del meristemo son genéticamente estables y por lo tanto las plantas regeneradas son idénticas a las plantas donadoras de los meristemos.

A partir del descubrimiento de Morel y Martin en 1952 de que se podían obtener plantas Dahlia sanas cultivando meristemos de plantas sistemáticamente infectadas por virus, se ha sucedido una ininterrumpida serie de aplicaciones de esta técnica para sanear diversos cultivos, especialmente en el caso de los que se propagan agámicamente. Esto se basa en la observación de que la concentración de virus disminuye hacia el ápice siendo posible en muchos casos encontrar la zona del meristema apical, libre de partículas.

En general se acepta que esta situación se debería a la ausencia de tejidos de conducción en la zona

meristemática y al hecho de que la activa división de sus células estaría dejando a estas fuera del alcance del virus.

El tamaño de la zona libre varía con la especie y virus involucrados. Así, en orquídeas es posible regenerar plantas sanas cultivando brotes apicales de 5 mm. de longitud mientras que en papa no se obtienen plantas sanas cuando los explantos exceden los 0,7 mm. de longitud.

De esto se deduce que para cada especie es necesario establecer el tamaño adecuado de los explantos para regenerar plantas libres de virus.

Si bien en algunos casos se obtienen plantas a partir del cultivo de domos solamente, en otros se necesitan por lo menos que el mismo esté acompañado de un primordio foliar.

Es claramente observable que hay que equilibrar dos situaciones que se contraponen. Por un lado, cuanto mayor es el tamaño del explanto, mayor es el desarrollo de las plantas, pero a su vez disminuye la probabilidad de obtener plantas libres de virus. Desde luego, como este es el objetivo principal, el porcentaje de regeneración de plantas pasa a ser secundario.

Cuando se extrae un meristema para colocarlo en un medio artificial se le priva de la mayoría de los nutrientes minerales y orgánicos que reciben de otros órganos de la planta. Para que su potencia continúe al cultivarlo in vitro, es necesario suministrarle esos nutrientes al medio. Un adecuado equilibrio de reguladores de crecimiento es esencial para conseguir regenerar las plantas. Además del suministro exógeno de hormonas es necesario tener en cuenta que en el mismo meristemo también existe una determinada concentración de estas. Obviamente la disponibilidad de reguladores endógenos se relaciona con el tamaño del explanto y parece ser la causa determinante de que por debajo de ciertas dimensiones no haya desarrollo.