4.1. Transformación de organismos

El proceso de producción de un ADN recombinante comienza con la identificación desde un organismo de una secuencia de ADN de interés con el fin de propagarlo en otro organismo que carece de la secuencia y, por ende, del producto protéico de esa secuencia de ADN.² Así se pueden producir cantidades ilimitadas de la proteína codificada por el susodicho gen. En términos simples, el procedimiento consiste en:³

·         Localización de genes y sus funciones.

·         Clonación del ADN, y su posterior almacenamiento en genotecas.

·         Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

·         Utilización de vectores de expresión.

Gran variedad de técnicas que los biólogos moleculares utilizan para manipular las moléculas de ADN uniendo segmentos de ADN en un lugar fuera de la célula u organismo, para luego introducirlas en una célula y hacerlas replicarse allí, por sí mismas, o después de haberse integrado en un cromosoma celular. Proviene de la unión artificial de dos fragmentos de ADN. De esta manera podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria, hongo) o un virus produzca una proteína que le sea totalmente extraña.

PROCEDIMIENTO OBTENENCIÓN DEL ADN PASAJERO . Este ADN contiene el gen deseado. PREPARACIÓN DEL ADN PASAJERO . Se le coloca la secuencia de nucleótidos que reconocen la enzima de restricción UNIÓN DEL ADN PASAJERO AL PLÁSMIDO O VECTOR . El plásmido debe tener una secuencia que reconozca la enzima de restricción que estamos usando. Se abre el plásmido con esta enzima y se le añade el ADN pasajero, obteniendo una molécula de ADN recombinante. TRANSFORMACIÓN . Las moléculas recombinantes son introducidas a la célula huésped.

Transformación del DNA.

Uno de los mecanismos por el cual el DNA puede movilizarse entre las bacterias es la transformación, descubierta por Fred Griffith en 1928. La transformación consiste en la captación por parte de una célula receptora de una molécula o fragmento de DNA desnudo y la incorporación de esta molécula al cromosoma del receptor en una forma heredable. En la transformación natural, el DNA procede de una bacteria donadora. Es un proceso aleatorio, y puede transferirse cualquier porción del genoma entre bacterias.

Cuando las bacterias se lisan, liberan unas cantidades considerables de DNA al medio que las rodea. Estos fragmentos liberados pueden ser relativamente grandes y contener diversos genes. Si un fragmento establece contacto con una célula competente, es decir, una célula capaz de captar DNA y ser transformada, dicho fragmento puede unirse a la célula y ser transportado a su interior. La frecuencia de transformación de las células muy competentes cuando se utiliza un exceso de DNA es de alrededor de 10 -3 para la mayoría de los géneros. Es decir, aproximadamente una célula de cada mil toma e integra el gen. La competencia es un fenómeno muy complejo y depende de diversas condiciones. Es preciso que las bacterias se encuentren en una determinada fase de crecimiento, por ejemplo,  S.pneumoniae se vuelve competente durante la fase exponencial, cuando la población alcanza las 107 ó 10 8 células/mL.

Cuando una población se vuelve competente, las bacterias del tipo de los neumococos segregan una pequeña proteína denominada “factor de competencia” que estimula la producción de 8 a 9 nuevas proteínas necesarias para el proceso de transformación. La transformación natural sólo se ha descubierto hasta la fecha en ciertos géneros de bacterias grampositivas y gramnegativas: 

Streptococcus,  Bacillus,  Thermoactinomyces,  Neisseria,  Moraxella,

Acinetobacter,  Azotobacter y  Pseudomonas, aunque otros géneros también puede que sean capaces de experimentar transformación.

La transferencia de genes mediante este proceso ocurre en medios terrestres y marinos, y puede constituir una importante ruta de intercambio genético en la naturaleza.

La transformación en Haemophilus influenzae, una bacteria gramnegativa, difiere de la de S.pneumoniae en diversos aspectos. Haemophilus no

produce un factor de competencia para estimular el desarrollo de competencia, y sólo capta el DNA procedente de especies estrechamente

relacionadas. El DNA bicatenario forma complejos con proteínas y es captado por vesículas de membrana. La especificidad de la transformación

de Haemophilus se debe a una secuencia especial de pares de bases (5'-AAGTGCGGTCA-3') que se repite unas 1.400 veces en el DNA de

H.influenzae. El DNA debe contener esta secuencia para que una célula competente se una a él.

La transformación artificial se lleva a cabo en el laboratorio mediante diversas técnicas, entre ellas el tratamiento de las células con cloruro

cálcico, que aumenta la permeabilidad de sus membranas al DNA. Este enfoque tiene éxito incluso con especies que no son competentes de

forma natural, como  E.coli. Para aumentar la frecuencia de transformación se utilizan concentraciones relativamente más altas de DNA,

superiores a las que están presentes en condiciones normales en la naturaleza. Cuando se utilizan para la transformación fragmentos lineales

de DNA, suele hacerse que E.coli pierda la actividad de una o más exonucleasas con el fin de proteger los fragmentos transformantes. Resulta

más sencillo transformar bacterias con DNA de plásmido, ya que los plásmidos no se degradan con tanta facilidad como los fragmentos lineales

y son capaces de replicarse dentro del huésped. Éste es un método habitual para introducir DNA recombinante en las células bacterianas.

Puede introducirse DNA de cualquier fuente en las bacterias insertándolo en un plásmido antes de la transformación.