4.2.4. Vectores de clonación
Los vectores de
clonación son moléculas transportadoras que transfieren y
replican fragmentos de ADN que llevan insertados mediante
técnicas de ADN recombinante. Para que sirva de vector, una
molécula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que
transporta. También tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan
la inserción del fragmento de ADN aclonar.
Para insertar
un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restricción, y
se mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.
Los vectores
que transportan un fragmento insertado se denominan vectores recombinantes.
Tipos de vectores
Hay muchos
vectores de clonación, que difieren en la especificidad de la célula huésped, el tamaño de los insertos que
pueden transportar y en características como el número de copias que producen y
el número y tipo de genes marcadores que contienen, entre otras.
Plásmidos
Los plásmidos fueron
los primeros vectores que se desarrollaron, y aún son ampliamente usados. Estos
vectores proceden de moléculas de ADN de doble cadena extracromosómicas que se encuentran de manera natural y
que se replican autónomamente dentro de las células bacterianas.
pUC18
Es un plásmido
muy utilizado, ya que presenta unas características que son muy beneficiosas:
- Es pequeño,
de modo que puede transportar fragmentos de ADN relativamente grandes (de unos
10.000 pares de bases).
- Tiene un
origen de replicación y puede producir hasta 500 copias de los fragmentos de
ADN insertado por célula.
- Se ha
modificado para que presente muchas secuencias de reconocimiento para enzimas
de restricción que se han agrupado en una región denominada polylinker o multiple
cloning site.
- Permite la
identificación sencilla de los plásmidos recombinantes, ya que contiene un
fragmento del gen bacteriano lacZ que produce colonias de color azul. Si
se inserta un fragmento de ADN en el polylinker, se inactiva este gen, y
da lugar a colonias de color blanco.
Bacteriófago lambda
El genoma del fago lambda se
ha cartografiado y secuenciado completamente. Para ser utilizado de vector, el
tercio central de su cromosoma puede ser reemplazado por ADN foráneo, sin que
ello afecte a la capacidad del fago de infectar células y formar cápsides.
Para clonar
ADN utilizando este vector, se purifica el ADN del fago y se corta con una
enzima de restricción, con la misma enzima de restricción cortamos el fragmento
de ADN de interés y los unimos con una ADN ligasa. Los vectores lambda
recombinantes se empaquetan in vitro en las cápsides proteicas del fago, y se
introducen en células huesped bacterianas. Dentro de las bacterias, los
vectores se replican y forman muchas copias del fago infectivo, llevando todas
ellas el fragmento de ADN de interés en la clonación. Los vectores fágicos
pueden transportar fragmentos de hasta 20 kb ( kilobases).
Cósmidos
Los cósmidos son vectores hibridos
utilizando partes del cromosoma de lambda y de plásmidos. Tienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el
empaquetamiento del ADN del fago dentro de su cubierta proteica, además
contienen secuencias plasmídicas necesarias para la replicación y genes de
resistencia a antibióticos. Los cósmidos pueden transportar casi 50 kb de ADN
insertado.
YAC
Los YAC son
cromosomas artificiales de levadura. Un YAC tiene telómeros en sus extremos, un
origen de replicación y un centrómero. Estos componentes están unidos a genes
marcadores de selección y a un grupo de enzimas de restricción para insertar ADNexógeno.
Estos
cromosomas artificiales de levadura permiten clonar grandes trozos de ADN, de
100 a 1000 kb.
BAC
Un BAC es un cromosoma artificial
bacteriano, basado en el plásmido de fertilidad ( factor F ) de bacterias.
El factor F es
un plásmido que se replica independientemente y que transfiere información
genética durante la conjugación bacteriana.
Los BAC pueden
transportar insertos de hasta 300 kb.
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