3.5.1. Aspectos importantes en la conservación in Vitro

3.5.1. Aspectos importantes en la conservación in Vitro

actualmente, el cultivo in vitro de tejidos vegetales es considerado una herramienta fundamental en el desarrollo agrícola y en la conservación de plantas de importancia económica y/o ecológica, debido a que proporciona alternativas para la solución de problemas presentados en los programas de propagación de plantas, donde los métodos tradicionales hasn resultado ser poco eficaces en algunos casos.

A.   Permite obtener plantas libres de enfermedades.

B.   La micro propagación vegetal nos permite propagar masivamente material vegetal en cualquier época del año y en corto tiempo conservando su potencial genético y calidad sanitaria.

C.   Permite optimizar el uso de factores ambientales y nutricionales.

D.   Facilita el cultivo de ungran numero de plantas en una superficie pequeña

E.   Puede conservar material biológico por periodos de tiempo prolongados.

F.    Además mediante este método de propagación se puede incluir aspectos de fitomejoramiento.

3.5 Conservación In Vitro

3.5 Conservación In Vitro

Existen variadas estrategias de conservación de recursos fitogenéticos, las cuales dependen del tipo de germoplasma y de los objetivos de la conservación. En el caso de especies que desarrollan semillas de tipo ortodoxas (cereales, leguminosas, oleaginosas, forrajeras) el sistema de conservación recomendable son los bancos de germoplasma, sin embargo existe un número importante de especies que se caracterizan por no producir semilla botánica, teniendo como alternativa de reproducción órganos vegetativos, como tubérculos, rizomas, bulbos etc. Para este grupo la conservación de germoplasma en campo es una alternativa, pero ofrece dificultades de manejo y riesgo de pérdida por condiciones climáticas adversas o catástrofes naturales. En este caso las técnicas recomendables son el cultivo in vitro y la criopreservación.

La criopreservación, otra técnica de laboratorio, se basa en la reducción y detención de las funciones metabólicas de los materiales biológicos a temperatura del nitrógeno líquido, es decir a -196 ºC, manteniendo por periodos indefinidos, la viabilidad de los materiales conservados.
El cultivo in vitro es un método de propagación de plantas de aplicación profesional, puesto que se realiza en laboratorio, en unas condiciones estériles y con unas instalaciones especiales. Lo fundamental es que se hace en unas condiciones muy controladas y totalmente estériles: utensilios, cámara de manipulación, etc., todo está desinfectado en autoclave. La planta ya desarrollada en el cultivo in vitro necesita una primera aclimatación en el laboratorio; en el invernadero y después una segunda aclimatación en el campo. Los viveros grandes realizan ambas operaciones; otros sólo se encargan del primer paso.

3.4.4. Aplicación agronomica

3.4.4. Aplicación agronomica

La población de células resultantes de estos procesos de fusión va a ser una mezcla de protoplastos parentales, homocariontes y heterocariontes con dos o mas núcleos.
Para seleccionar los productos de fusión de interés, es necesario utilizar medios restrictivos para células no híbridas, o que produzcan una proliferación diferencial para las células híbridas y/o incorporar un sistema de marcaje que permita reconocer y seleccionar los productos híbridos. Un tipo de selección clásico es el basado en la complementación de mutantes no alélicos (por ejemplo la combinación de dos mutaciones recesivas albinas no alélicas que permiten la detección de los híbridos simplemente por su color; Melchers y Labib, 1974), existiendo otros muchos métodos de selección (incorporación de mutaciones de deficiencia, de resistencia, etc.) y tambien métodos de verificación del caracter híbrido en plántulas regeneradas, como el examen de los patrones morfológicos y/o isoenzimáticos.
Debemos señalar que una vez obtenidos híbridos somáticos interespecíficos por fusión de protoplastos y regeneración de los productos seleccionados, estos híbridos van a ser distintos a los híbridos obtenidos sexualmente.

Las plántulas obtenidas por fusión somática, pueden ser a nivel nuclear de varios tipos:

a) Híbridos somáticos típicos;

b) Poliploides;

c) Aneuploides s (híbridos asimétricos;

d) Híbridos con el contenido nuclear de un parental y fracciones de información genética del otro parental (de uno a miles de genes).

A nivel citoplásmico las plantas híbridas pueden presentar:

a) La suma de los citoplasmas de ambos parentales;

b) El citoplasma de un solo parental;

c) Un citoplasma híbrido resultado de la recombinación de los genomas extranucleares de ambas células.

Por ello el conjunto de combinaciones nucleares y citoplásmicas conforma un enorme número de posibilidades teóricas.
La fusión de células somáticas puede aplicarse para

1) La superación de la incompatibilidad en cruces interespecíficos;

2) Un mejor aprovechamiento de la variación intraespecífica y extraespecífica en cruces interespecíficos compatibles, al ser los híbridos somáticos distintos y superiores a los sexuales, posiblemente por la combinación de genomas extranucleares (Moreno, 1984); 3)

La obtención de híbridos citoplasmáticos o cíbridos, al transferirse genes extracromosómicos, que confieren características especiales al híbrido (ej. androesterilidad citoplásmica).
Aunque la fusión de protoplastos ha sido utilizada con éxito para solventar problemas de incompatibilidad entre especies con los que tropezaba la mejora genética tradicional, y ha permitido obtener híbridos somáticos interespecíficos e intergenéricos, con especiales combinaciones genéticas nucleares y citoplásmicas, quizá la aplicación mas interesante de la fusión somática sea la transferencia de una cantidad limitada de información genética de una especie a otra, de forma poco controlada. Así, mediante tratamientos físico-químicos es posible inactivar o destruir total o parcialmente los núcleos de las células parentales, con lo que solo una parte desconocida de la información genética va a ser transferida al híbrido, que suele ser estéril. En determinados casos es posible mediante sucesivas retrofusiones eliminar casi todo el genoma de uno de los parentales (ej. el híbrido resistente a atrazina entre Solanum nigrum y Lycopersicon esculentum; Jain et al., 1988). Otro caso modelo de cibridación es el Brassica-Raphanus (Pelletier et al., 1983): el heterocarionte contiene el núcleo de Brassica napus, los cloroplastos resistentes a atrazina de Brassica campestris y las mitocondrias de Raphanus sativa que confieren androesterilidad.
Para asegurar el desarrollo de estos nuevos productos, estos suelen integrarse en programas clásicos de mejora, pero para ello necesitan cumplir dos condiciones (lo mismo que los híbridos sexuales convencionales): uno, deben ser al menos parcialmente fértiles para permitir retrocruzamientos (híbridos somáticos tetraploides); y dos, en los retrocruzamientos se deben transferir solo un pequeño número de genes, ya que los caracteres multigénicos son incontrolables.
Todos estos métodos se encuentran aún en fase experimental, limitados por el reducido número de especies a las que es posible aplicarlos por cuestiones técnicas y por lo poco controlable que es la transferencia de material genético, ademas en clara competencia con otros métodos de transformación genética (Agrobacterium, ...), tal vez técnicamente más sencillos, rápidos y dirigibles, que a pesar de todo no invalidan el método de fusión de protoplastos para la obtención de nuevos productos para la mejora vegetal.

Los cultivos de suspensiones vegetales tienen un amplio rango de aplicaciones constituyendo una técnica muy valiosa en los estudios sobre:

1) la regulación del ciclo celular,

2) la replicación del ADN y la síntesis de proteínas

3) la transferencia de material genético,

4) la absorción y transporte de nutrientes, 5) los diferentes eventos metabólicos,

6) la producción de metabolitos de interés en las industrias alimenticias, de fragancias y  farmacéuticas,

7) el aislamiento y la selección de mutantes, 8) los procesos de diferenciación y desarrollo de los embriones resultantes de la embriogénesis somática,

3.4.3. Fusión de protoplastos

3.4.3. Fusión de protoplastos

La fusión de protoplastos es una técnica de biotecnología en la cual se produce la fusión de las membranas de dos o más células dando lugar a un híbrido somático. La técnica es ampliamente empleada para introducir variabilidad en las cepas de interés biotecnológico. Típicamente se realiza mediante protoplastos vegetales, esto es, células vegetales desprovistas de pared celular, si bien también puede efectuarse empleando otros taxones, como algunos hongos.^[]

En biotecnología vegetal, la fusión de protoplastos se emplea en programas de mejora; un ejemplo es la generación de poliploides, generalmente más productivos. Para ello la metodología consiste en aplicar pulsos eléctricos a células en suspensión (electroporación) o inducir la desorganización de las membranas empleando polietilenglicol. Esta técnica, pese a mezclar el contenido genético de dos líneas distintas, no está considerada ingeniería genética, pues en su ejecución no se emplea la tecnología del ADN recombinante.^[]

La técnica de fusión de protoplastos surge como especialidad o aplicación a partir de las técnicas de aislamiento y cultivo de protoplastos, que permiten la obtención de células desprovistas de pared celular gracias a la acción de enzimas líticos (celulasas, pectinasas) obtenidos de microorganismos (Aspergillus sp.; Trichoderma viride; Rhizopus sp.), y su posterior crecimiento (división celular, formación de microcallos y regeneración de plántulas por vía organogénica o embriogénica).
Aunque circunstancialmente ocurren fusiones espóntaneas entre protoplastos, y en este hecho se encuentra el origen de esta técnica, es necesario aumentar la eficacia del proceso y «dirigirlo» mediante sistemas de inducción adecuados. Los procesos de inducción son de dos tipos: Químicos, en ellos se usan sustancias aglutinantes como el polietilenglicol (PEG) o el dimetilsulfóxido (DMSO) y, Físicos, como la electrofusión, que consiste en la inducción de una dipolarización de los protoplastos mediante corrientes alternas de alta frecuencia, que van a hacer contactar y alinearse a los protoplastos siguiendo las líneas del campo eléctrico generado, y en ese momento con un pulso de corriente continua se consigue la fusión de las células.

4.3.2 Variación somaclonal

           4.3.2    Variación somaclonal

La variación somaclonal es la variación genética o epi genética que se genera durante el cultivo in vitro de plantas (cultivos celulares de tejidos u órganos) que provenga de células somáticas. En programas de mejoramiento genético, la variación somaclonal puede constituirse en un recurso importante que genera variabilidad. Sin embargo, durante la micropropagación y en bancos de germoplasma in vitro, este tipo de variación es indeseable. En vista de lo anterior, se han utilizado una serie de técnicas moleculares para su detección

El cultivo in vitro puede ser células vegetales un ambiente muy estresante e involucra procesos mutagénicos durante el establecimiento del explante, la inducción de callo, la formación de embriones y la regeneración de plantas. Por esta vía es posible obtener variación, de origen nuclear y/o citoplasmática, que podría ser utilizada para el mejoramiento vegetal. Este proceso, se denomina Variación Somaclonal, involucra cambios en las plantas regeneradas que son transmitidos a la progenie.

Entre las causas que original la variación somaclonal se encuentran alteraciones en el cariotipo, mutaciones puntuales, recombinación somática e intercambio de cromátidas hermanas, rearreglos génicos somáticos, elementos genéticos transponibles, amplificación y/o metilación del ADN y cambios en el ADN de los orgánelos (mitocondrias y cloroplastos).

                
Factores relacionados con la aparición de variación somaclonal

·         Genotipo → En general se asume que la frecuencia de cambios dependerá de variaciones preexistentes en el genotipo y de las interacciones que surgen entre el genotipo y el proceso de cultivo.

·          Explante → Se puede dar como consecuencia de quimerismo Si estos tejidos se utilizan como explantes y sus células son inducidas a dividirse y rediferenciarse, las diferentes líneas celulares podrían entonces dar origen a plantas genéticamente diferentes. 

·         Fase de callo → La iniciación de un callo puede ser análoga a la respuesta de las plantas a heridas, que se sabe que activan elementos transponibles y estimulan la inducción de enzimas y productos específicos que se inducen también en situaciones de estrés. Cuando comienza la división celular a partir de tejidos diferenciados, que dará origen a un callo, se incrementa el riesgo de inestabilidad cromosómica. La variación que ocurre en los números cromosómicos en la primera fase de la inducción del callo sería el resultado de fragmentación nuclear seguida por mitosis de los fragmentos nucleares, combinada con la mitosis normal de los núcleos intactos (núcleos euploides).

·         Vía de regeneración → La variación observada en cultivos embriogénicos es relativamente menor que la que aparece en cultivos organogénicos. Esto probablemente se debe a la gran presión de selección impuesta en la formación de los embriones, mayor que la requerida en la formación de vástagos. El gran número de genes requeridos para la iniciación y maduración de embriones cigóticos y somáticos impediría la acumulación de mutaciones deletéreas.

·         Naturaleza del callo → Un callo verdadero es una masa de células desdiferenciadas que proliferan Desorganizadamente, lo cual probablemente genera considerable variación.

·         Medio de cultivo → Un mismo explanto puede tener diferente comportamiento si se lo cultiva en medio sólido o en medio líquido. Otro factor importante es la temperatura, que puede inducir inestabilidad cariotípica o puede incrementar el número de plantas albinas.

·         Reguladores de crecimiento → El 2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético) ejercen profundos efectos sobre la respiración celular, el consumo de azúcares y en el control de la división celular.Por ello se especula acerca de su rol indirecto en la inducción de cambios en el metabolismo celular y tisular de plantas creciendo in vitro. La auxina:citocinina, produce fragmentación nuclear amitótica y se le reconoce como causa de aneuploidía. El 2,4-D, el AIA (ácido indolacético) y el ANA (ácido naftalenacético) han sido señalados como los responsables de los incrementos en la metilación de la citosina que tiene lugar durante el cultivo in vitro.

·         Deficiencia de oxígeno → La tensión de oxígeno de las células en la superficie del callo es diferente a la de aquellas células que se encuentran situadas profundamente en la masa del mismo. La anaerobiosis resultaría en la producción de etanol, el cual podría comportarse como un mutágeno.

·         Acumulación de metabolitos → Las condiciones de cultivo in vitro podrían afectar los niveles de resistencia celular al efecto de los metabolitos que normalmente se encuentran presentes en los tejidos en bajas concentraciones.

·         Edad del cultivo → En los períodos prolongados de cultivo hay una pérdida de totipotencia y que esto sucedería debido a la acumulación de mutaciones y a la alteración de los genes que son responsables de la regeneración.

·         Deficiencia o exceso de minerales → Las deficiencias o excesos de azufre, fósforo, nitrógeno, calcio y magnesio pueden resultar en cambios genómicos.

Desventajas de la Variación Somaclonal

Ø  En algunos casos, las variantes somaclonales no han avanzado de la etapa de laboratorio o invernáculo, probablemente debido a que el material seleccionado tiene poca importancia práctica.

Ø  La escasa regeneración de plantas en cultivos de largo término. Generalmente en estos casos existe pérdida de la capacidad morfogénica.

Ø   La regeneración está limitada a genotipos específicos que pueden no ser de mucho interés para los mejoradores.

Ø  Algunos somaclones son inestables (originados por variación epigenética).

Ø  Algunos presentan alteraciones no deseables como aneuploidía, esterilidad, etc.

 

3.4.1. Producción de haploides: cultivo de anteras y óvulos

3.4.1. Producción de haploides: cultivo de anteras y óvulos

Esta técnica es especial para mejoramiento genético. Las células de las plantas posees paredes de celulosa las cuales se pegan entre si debido a la pectina. El tratamiento enzimático de células y pectinasa divide a las células en unidades individuales (protoplastos). Se se cultivan los protoplastos , se pueden obtener series de complejos que han proliferado a partir de una celula madre.

Mediante esta técnica, las anteras inmaduras que contienen polen en una etapa específica de desarrollo se colocan en medios donde el polen inmaduro se divide para formar embriones o callo. Transferidos éstos a medios de regeneración, se forman plantas. En la mayoría de los casos se producen plantas haploides estériles, pero en algunas especies ocurre una duplicación espontánea de los cromosomas en las etapas de desarrollo del callo y de regeneración de la planta

El cultivo de anteras aplicado al fitomejoramiento

El potencial que posee el cultivo de anteras surge de la constitución genética de las células del polen. Las células del polen de los híbridos F₁ contienen la dotación genética de las plantas paternas y las recombinaciones esperadas según las proporciones mendelianas. Estas células son haploides y permiten por ello al mejorador selecciones eficazmente los recombinantes deseables; además, una vez duplicadas esas células, se establecen rápidamente líneas homocigóticas.

Ventajas del cultivo de anteras:

A)   Obtención de haploides duplicados a partir de híbridos F₁ puede ser útil para desarrollar variedades en forma fija en una estación central, con el fin de distribuirlas en ambientes ecológicos muy diversos y de ensayarlas en ellos.

B)   Crear y acrecentar reservas citogenéticas y citoplasmáticas de los principales cultivos.

C)   Etc

Cultivo de óvulos

El cultivo de óvulos se ha usado para rescatar embriones derivados de cruzamientos interespecíficos. Ha sido útil también para rescatar híbridos intergenéricos, y para rescatar embriones abortados en uvas sin semillas.

Factores que afectan el cultivo

Placenta: la velocidad del desarrollo embrionario en los cultivos de óvulos se puede aumentar, algunas veces, por medio del cultivo de óvulos con la placenta todavía adherida a ellos

3.4. Técnicas in Vitro aplicadas al fitomejoramiento

 3.4. Técnicas in Vitro aplicadas al fitomejoramiento

esta técnica se utiliza especialmente para inducir plantas Haploides, las células haploides tienen la mitad de cromosomas de una planta normal. El reactivo que se utiliza para doblar la cantidad de cromosomas se llama colchicina, el cual despues de aplicarlo provoca que la planta posea los pares de cromosomas completos. Esos materiales son homocigóticos (línea pura), por consiguiente, si algunos poseen un carácter deseable, son utiles para cruzamientos