3.3.2 cultivos de meristemos apicales
PRODUCCIÓN DE PAPA LIBRE DE VIRUS
En el caso de papa, como en todas las especies de propagación agámica, los virus tienen una particular importancia por su acumulación en los materiales de propagación y su incidencia en los rendimientos. Se citan en esta especie más de 20 virus que afectan el cultivo, pero solo 3 ó 4 son de significativa importancia en la
Argentina (PVY, PLRV, PVX y PVS).
La única herramienta disponible actualmente para obtener plantas libres de virus de manera eficiente y confiable, es utilizando las técnicas de cultivo de tejidos in vitro.
DESCRIPCIÓN Y REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA
Luego de cosechados y suberificados, los tubérculos seleccionados de los cuales se desea extraer meristemas son sometidos a tratamiento para romper dormición en el caso de que sea necesario.
Luego de transcurridos 15 días en una cámara de brotación a 20 °C aproximadamente, los tubérculos desarrollan brotes de 1 cm. de longitud. En este momento se procede a cortarlos. Inmediatamente se los desinfecta sumergiéndolos unos segundos en alcohol y luego en hipoclorito de sodio al 2% durante 10 – 15 minutos. El recipiente que contiene estos brotes es introducido bajo cámara de flujo laminar ya acondicionada para trabajar. Una vez transcurrido el tiempo de desinfección los brotes son lavados por lo menos 3 veces con agua destilada estéril para eliminar los restos de hipoclorito y colocados en una caja de Petri también estéril.
De aquí se van tomando los brotes para realizar la extracción de los meristemas. El trabajo se realiza bajo el campo visual de una lupa binocular con luz puntiforme, utilizando herramientas tales como bisturíes, pinzas y
microcuchillas.
1. Extracción del meristema
Sobre papel estéril y con ayuda de una pinza que sostiene la base del brote se procede a cortar con un bisturí
las hojas y primordios exteriores, cuidando de no dañar el meristema apical y dejándolo limpio de tejidos adyacentes.
Una vez descubierto el domo se lo extrae con 1-2 primordios foliares utilizando una microcuchilla. Por lo general, el corte se realiza perpendicular al eje del meristema entre 0.1 y 0.2 mm por debajo de la superficie del domo. El explanto adherido a la microcuchilla es transferido a un tubo con medio de cultivo. Es conveniente depositarlo con el ápice hacia arriba para facilitar el crecimiento armónico del tejido.
Inmediatamente después se tapa el tubo con polietileno termocontráctil que permite el intercambio gaseoso con el ambiente.
2. Incubación
Los tubos sembrados se incuban en cámara de cría a 25 ± 2 °C con 70% de Humedad Relativa. La luz es suministrada con tubos fluorescentes usándose una intensidad de 2000 lux y un fotoperíodo de 16 horas.
3. Desarrollo del cultivo
En el transcurso del proceso de desarrollo se pueden realizar 3-4 repiques o subcultivos de los explantos en el mismo medio, con una frecuencia variable entre 1 y 2 semanas. Se efectúan lecturas periódicas para observar el desarrollo y descartar tubos contaminados y meristemas muertos o que al cabo de cierto tiempo no hayan experimentado ningún crecimiento. A los 75-80 días se obtienen las primeras plántulas completas. Estos explantos, que por lo general poseen 4-5 nudos, son micropropagados en un medio adecuado.
4. Evaluación de sanidad: método de detección de virosis de papa
Con 1 ó 2 de las plantas obtenidas en estas primeras micropropagaciones se inicia el control sanitario mediante la aplicación del test ELISA, hospedantes diferenciales y, eventualmente, microscopía electrónica para detectar PLRV, PVY, PVX y PVS. Los mericlones que dan reacción negativa en estas pruebas se continúan multiplicando “in vitro”, realizándose por lo menos 2 o 3 controles más sobre los mismos.
Por otro lado, algunas microplantas de estos materiales son transferidas a tierra con el fin de que desarrollen plantas de mayor porte con lo que se facilita la multiplicación de eventuales partículas de virus remanentes que no fueron detectadas en el material in vitro. De esta forma quedarán en evidencia al realizarse nuevos controles.
Los controles de sanidad se llevan a cabo durante por lo menos un año antes de destinar los materiales definitivamente libres de virus a la multiplicación masiva para su utilización en la producción de minitubérculos.
