Laura Campos Diaz: octubre 2012

martes, 30 de octubre de 2012

2.3.7.4 MANEJO DEL MATERIAL TRASPLANTADO

El trasplante es un proceso “traumático” para las plántulas, especialmente cuandola mano de obra que lo ejecuta no es calificada o carece de experiencia. Las plántulas sufren un estrés microclimático cuando pasan de los frascos a las mini cámaras húmedas, debido a los siguientes factores: Deshidratación, paso de un sustrato rico en nutrientes a otro muy pobre en ellos (mezcla de turba y cascarilla de arroz), daños mecánicos casi inevitables en varias partes de la plántula (cofia, pelos absorbentes, raíces, tallo y hojas).

Del cuidado con que se hagan las actividades del trasplante depende el éxito de la climatización de las plántulas y su supervivencia. El trasplante debe hacerse inmediatamente después de extraídas las vitroplantas de sus frascos. Cuando este proceso se realiza por primera vez y no se conocen muy bien las condiciones ambientales de las instalaciones en que se realizará, se sugiere que se inicie a las 17:00h todos los días con el fin de evitar la deshidratación de las plántulas. Las actividades más importantes del proceso son las siguientes:

Selección: Se inicia el proceso con una primera selección de los frascos que contengan las plántulas más vigorosas, o sea, las de color verde intenso que estén erguidas y cuyo tamaño oscile entre 5 y 7 cm.

Extracción de las vitroplantas: Esta operación consta de los siguientes pasos:

• Retirar la cinta plástica y la tapa de los frascos.

• Agregar agua desionizada al frasco para humedecer el sustrato de agar y facilitar la extracción del conjunto (plántula + agar).

• Sostener el frasco con una mano y golpearlo con la otra suavemente hasta desprender el agar de las paredes del frasco. Si así no despega, se usa una espátula teniendo cuidado de no dañar las raíces.

• Extraer delicadamente la plántula, inclinando el frasco; no se utilizan pinzas para reducir el riesgo de causar daño al tallo.

• Colocar la plántula en un recipiente amplio (bandeja onda) con agua desionizada, donde puedan moverse libremente las manos para retirar el agar.

• Retirar suavemente con el frasco lavador, las partículas de agar que sigan adheridos a las raíces.

• Hacer la segunda selección de plantas vigorosas, eliminando las pequeñas, las mal formadas y las débiles.

Se destapa cierto número de frascos. Se añade agua al frasco para extraer la plántula junto con el agar.

Trasplante Con una mano se lleva la plántula, introduciendo en esta su raíz y la parte inferior del tallito; esta mano debe mantenerse rígida para evitar la rotura de pelos absorbentes y de raíces de la plántula, con la otra mano se agrega la cuarta parte de sustrato que no se había añadido, procurando que las raíces queden en posición normal, o sea, como se encontraban en el frasco: así se evitará que sufran algún efecto adverso (mecánico o fisiológico) debido al cambio de posición. Una vez hecho el trasplante en todas las bolsas de la bandeja, las plántulas reciben el segundo riego con 10cc. De la mezcla de fertilizante y fungicida usadaantes. Cámara húmeda y endurecimiento: Los siguientes pasos dan comienzo al proceso real de endurecimiento de las plántulas:

•

•. Mantenimiento de las plantas trasplantadas:

En esta etapa se debe prestar mucha atención a los cambios microclimáticos que ocurran dentro de las instalaciones, al riego que requieran las plántulas, a su nutrición, y a la presencia en ellas de plagas y enfermedades. Se recomienda, además, no mover las bolsas con las plántulas durante el primer mes después del trasplante para no causar daño en las raíces (especialmente en la cofia, y en los pelos absorbentes). Estas partes de la planta son frágiles y quebradizas en esta etapa temprana de su desarrollo. Los daños o roturas en los tejidos radicales aumentan la probabilidad de que entre en la planta un organismo patógeno o de que se retrase su crecimiento y desarrollo (o de que ocurran ambas cosas).

Riego: Si se han regado las plántulas con la cantidad correcta de solución nutritiva (verantes) y se ha formado bien el ambiente de la minicámara húmeda, las plántulas no necesitan riego en esta etapa. Si se presentan (y sólo entonces) los primeros síntomas de marchites fisiológica de las plántulas una vez retirada la bolsa grande de la cámara húmeda, el sustrato recibe el tercer riego. Se procura no humedecer las hojas para alejar el riesgo del ataque de algún patógeno. Cada plántula se riega con 10cc. De una solución nutritiva que consiste en una mezcla de 2g de fertilizante rico en fósforo para promover la formación de raíces (10-52-10), y 1g de agrimins (un fertilizante ricoen elementos menores) por litro de agua desionizada.

Según las condiciones microclimáticas de las instalaciones y según el estado de turgencia de las plántulas, se pueden programar luego uno o dos riegos diarios, cada uno con 10cc. Del agua que se utiliza normalmente en el riego de otras plantas. Se recomienda que entre los 21 y 25 días después del trasplante, se implemente en la casa de malla un riego por microaspersión con el cual se reduce mucho el costo de la mano de obra. Se recomienda dar a las plántulas de2 a 3 minutos de RMA en la mañana, y si es necesario, otros 2 0 3 minutos en la tarde. Cuando se aplica el RMA, es indispensable hacer inspecciones rigurosas para detectar cualquier problema fitológico en las plántulas. El secreto de esta operación, que es decisiva para el éxito del PE; está en aplicar el riego cuando se observen los primeros síntomas de marchites fisiológica; de este modo, el sustrato no permanecerá muy húmedo y así se evitará un posible ataque de organismos patógenos en el área radicular. Es importante recordar que, en esta etapa, las plántulas son susceptibles el exceso de humedad del sustrato.

Apertura total de la cámara húmeda a los 8-12 días del proceso deendurecimiento. Plántulas de una bandeja ya adaptadas al microambiente (8-12 díasdespués del trasplante.

Fertilización: El sustrato utilizado es poco fértil; por tanto, es indispensable trazar un programa de fertilización. Cada 8 días se fertilizarán las plántulas con macronutrientes y micronutrientes para que se desarrollen normalmente. Se aplica inicialmente un compuesto rico en fósforo para favorecer el desarrollo radicular (10-52-10); esta aplicación se alterna (con intervalos de 8 días) con fertilizante completo que contenga elementos mayores y menores. Si no se consigue en el mercado el fertilizante 10-52-10, puede sustituirse por la combinación del fertilizante 10-30-10 y el agrimins. Se suspende la fertilización cuando el color de las plántulas sea el que se considere normal para la variedad de gerbera a la que pertenecen. Si se presentan síntomas puntuales de deficiencia de algún elemento, se puede dar a las plántulas afectadas una fertilización foliar que contenga fertilizantes simples o compuestos. Una de las deficiencias que suelen presentar las plántulas en el primer mes es la de cinc, que se corrige adicionando el elemento al suelo en uno de los riegos; se disuelven por tanto, 3g de Zn en 1 litro de agua de riego y se aplican 10cc.de esta solución por planta. Riego de las plántulas con solución nutritiva cuando presentan síntomas de marchites.

Separación de las plántulas: De 30 a 34 días después de haber trasplantado, las plántulas necesitan más luminosidad y mayor temperatura para estimular su crecimiento y desarrollo. Por tanto se colocan las plantas más separadas en un área que sea el doble o el triple de la que ocupaban inicialmente. Finalmente las plantas permanecen en la casa de malla durante un lapso de 70 a90 días; transcurrido este tiempo son llevadas a campo.

2.3.7.3 TRASPLANTE Y ADAPTACIÓN BAJO CONDICIONES DE INVERNADERO

Las plántulas entre 4 y 5 cm obtenidas in vitro una vez que desarrollaron sus raíces y se han alongado, se traslada a un invernadero, procurando realizar esta actividad por la mañana para no dañarlas por el calor. Ya dentro del invernadero, la preaclimatización consistió en que los frascos se destaparan, dejándose bajo malla sombra durante 48 horas, con la finalidad de que las plantas comenzaran a adaptarse acondiciones diferentes a las existentes en el laboratorio donde estaban a temperatura promedio de 26 ± 2 ºc y fotoperiodo de 10 horas luz (lámparas de luz blanca fría fluorescente, con intensidad lumínica de 2000 lux) y 14 horas de oscuridad. Antes de transplantar, se elimina completamente el medio de cultivo de las raíces, para ello se colocaran las plántulas en un recipiente con agua limpia y el medio se eliminara de las raíces manualmente sin dañar a las plántulas. Con la finalidad de evitar contaminación por enfermedades fungosas, las plántulas se sumer durante cinco minutos en un recipiente que contenga una solución preparada con fungicida. Para el trasplante se utiliza un sustrato el cual se esteriliza.

2.3.7.2 DESINFECCIÓN O ESTERILIZACIÓN DEL SUSTRATO

Existen dos formas básicas de esterilizar un sustrato, la olla express, y al baño maría. Recomiendo siempre usar olla express, ya que además de reducir los tiempos de esterilización es mucho más efectiva, sobre todo con los sustratos de grano entero.

-Baño María: Desde mi punto de vista lo mejor para utilizar este sistema es con el método PF. Tiempo de esterilización a partir de hora y media

-Olla express: Es el método más efectivo y más extendido. Existen multitud de ollas express, pero el funcionamiento será igual para todas. Habrá que poner algo en el fondo de la olla para que los vasos o tarros no reciban demasiado calor directo y se nos estallen a las primeras de cambio. Valdrá desde un escurridor metálico, hasta un paño de cocina(con trapos de este tipo lo mejor es asegurarse de que va suficiente agua, ya que no seriamos los primeros(me incluyo) que se quema el trapo dentro de la olla.
Consistirá en meter los vasos, añadiéndole 3cm de agua más o menos. Es algo bastante subjetivo, ya que depende del tamaño de olla, vasos, etc. Aunque el agua medie los vasos no pasará nada, pero más creo que podría ser arriesgado. Una vez dentro se cerrará la olla y se pondrá a fuego vivo hasta que llegue a una presión de (15 psi = 1 atm en presión atmosférica = 1000 gr/cm2) En mi caso mi olla no tiene medidor de presión, por lo que una vez que empiece a salir vapor de agua ya llegará a dicha situación. En este momento reduciremos el fuego y dejaremos esterilizar desde 1hora hasta hora y media(para centeno y alpiste creo que es lo mejor). Existe una forma muy visual de saber si la presión de dentro de la olla es la óptima, y esto es echar una gota de agua en la superficie de la olla cuando ya está esterilizando y ver lo que sucede. Si la gota de agua empieza a burbujear y se evapora rápidamente, se estará haciendo bien.

En todo momento deberá realizarse un riguroso control fitosanitario empleándose antibióticos, fungicidas e insecticidas de uso universal

2.3.7.1 TIPOS DE SUSTRATOS

Otro aspecto importante a tener en cuenta lo constituye la elección del sustrato, siendo el adecuado aquel que permita el normal crecimiento y desarrollo de las raíces. Se puede emplear: arena, perlita, turba, vermiculita, o mezclas de ellos, teniendo la precaución de realizar una esterilización previa. Es conveniente el agregado de fertilizantes, sea a través del substrato (fertilizantes de liberación controlada) o bien mediante el sistema de riego (fertilizantes solubles); empleándose proporciones ricas en fósforo (N-P-K: 9-45-15) y potasio (N-P-K: 4-25-35) que favorecerán el desarrollo radicular y la rustificación de las plantas.

2.3.7. TRASPLANTE AL SUSTRATO

Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un tamaño aproximado de 2 cm. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo de las auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren en forma simultánea.

En el momento en que se extraen los explantes enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante. Crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la pérdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta. Las plántulas recién enraizadas son sensibles a los cambios ambientales y esto va a depender del éxito o el fracaso. Mediante aclimatizacion (endurecimiento) entre 4-8 semanas

Paulatina y secuencialmente

1. Se controla la luz desde el 20% hasta el 100%

2. Sustrato en las 2 primeras semanas riega ms 25%

3. Humedad relativar se mantiene desde 100 normal

4. Se mantiene con nebulización

5. Normal se cortan las raíces de las plantas in vitro .

2.3. 6.4 PRE ADAPTACIÓN Y TRASPLANTE

Este período de adaptación al nuevo hábitat es llamado fase o etapa de aclimatación. La estrategia a implementarse durante el mencionado ciclo deberá contemplar el control minucioso de los parámetros ambientales (humedad, temperatura y luz) de tal manera que permita disminuir la deshidratación y, al mismo tiempo, estimular la fotosíntesis con el objeto de generar un rápido crecimiento de los plantines. El retraso en el desarrollo de la cutícula y la escasa funcionalidad del aparato estomático que presentan las hojas de la mayoría de las especies cultivadas in vitro, determinan una alta tasa de transpiración que puede ocasionar la muerte por deshidratación. El control de este proceso fisiológico es de vital importancia durante la aclimatación, teniendo en cuenta que la disminución de la transpiración será gradual y dependerá de la rehabilitación de los estomas, así como también del desarrollo de la cutícula.

El equipamiento necesario estará sujeto a la especie, pudiendo utilizarse desde túneles de polietileno para plantas que posean un elevado control de la transpiración (por ej. Malus pumila o Agave tequilana) o bien, a través del empleo de cámaras climatizadas equipadas con sensores que permiten un descenso paulatino de la humedad relativa. En algunos casos puede resultar necesaria la aplicación exógena de ABA (hormona involucrada en el control del cierre de los estomas) o bien, el empleo de sustancias antitranspirantes que forman una capa semipermeable en la superficie de la hoja. En este último caso deberán tomarse algunas precauciones debido a que pueden observarse reacciones de fitotoxicidad.

Resulta imprescindible evitar la exposición a temperaturas extremas tanto en la fase aérea como en el substrato. Mediante el empleo de extractores y/o acondicionadores de aire combinados con un sistema de niebla, es posible establecer la temperatura de la fase gaseosa entre los 25 y 30 ºC durante la estación estival, mientras que en la época invernal es necesario, a veces, el empleo de mantas térmicas o serpentinas, sea de agua o aire caliente a nivel del substrato, para mantener la temperatura por encima de los 18-20 ºC.

Sin lugar a dudas, la opción más económica es el empleo de la luz natural, disminuyendo su irradiancia (20-50%) mediante el agregado de mallas de sombreado («saram»). No obstante, en aquellas latitudes donde el nivel medio de luz natural es bajo y los días son cortos durante una parte considerable del año, la luz artificial puede ser aplicada como complemento de la luz natural. Las lámparas tubulares fluorescentes del tipo «luz día» son empleadas en horticultura para prolongar el fotoperíodo. Asimismo, las lámparas tubulares de sodio alta presión presentan una distribución espectral de la energía adecuada para estimular fotosíntesis y se emplean para tal fin en una amplia variedad de cultivos.

2.3. 6.3 ENRAIZAMIENTO

Para enraizar los explantos se utilizan principalmente dos métodos:

•
ENRAIZAMIENTO IN VITRO

• Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga auxinas. Esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar y como la fuente de energía para enraizar está en el medio de cultivo no es necesario que tengan las hojas muy bien desarrolladas para realizar la fotosíntesis.

• ENRAIZAMIENTO EX VITRO

• Los explantos se deben transferir a un sustrato limpio, aunque no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita.
Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía para enraizar y desarrollarse.
Los explantos deben de plantarse en contenedores cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar en el laboratorio, o ponerlos en 'multipots' dentro de un invernadero en un área sombreada.

Causas para variabilidad de enraizamiento

>Condiciones ambientales y de nutrición de la planta y de los esquejes

>Manejo de los explantes luego de su separación de la planta madre

>Concentración, método de aplicación y tipo de sustancia reguladora

>Interacción entre sustancias RC

>Edad de los esquejes

2.3. 6.2CRECIMIENTO DE YEMAS ADVENTICIAS

Entre los tipos de explantes hay porciones de hojas que se usan en plantas como Saintpaulia y rábanos picantes que de manera natural se regeneran de esta forma. Se utilizan explantes de puntas de tallos en varias especies como en orquídeas, y helechos en los cuales se desarrollan masas de tejidos de tipo callo y regeneran a un gran número de brotes, con el tiempo las plantas iniciadas de puntas de callos con el propósito inicial de brotes axilares, pueden revertir a formar alto porcentaje de brotes adventicios.

La iniciación directa principia con células de parenquima que están situadas ya sea en la epidermis o justo abajo de la superficie del tallo; algunas de esas células se vuelve meristemoides las cuales aparentemente se originan de células individuales, sin embargo, la respuesta de los explantes depende de la concentración de hormonas El desarrollo indirecto de brotes adventicios implica, primero la iniciación de callo basal de los brotes separados en cultivos, Los brotes se originan en la periferia del callo e inicialmente no están conectados al tejido vascular del explante, de manera similar, en plantas intactas, si se aplica citoquinina en bloques de agar cilíndrico pueden originarse de brotes del callo formado en el ápice de epicotilos decapitados. En general la formación de brotes adventicios puede conducir a tasas muy elevadas de multiplicación, mas altas que los que se obtienen de ramas axilares. Por otra parte, los brotes adventicios pueden aumentar las tasas de producción de plantas aberrantes, resultantes de la partición de quimeras que en algunos cultivares resulta en la perdida de la variegacion y en reversiones a una condición más juvenil, cuando se use este sistema las plantas producidas deben evaluarse cuidadosamente respecto a la posible variación. Las diferentes plantas pueden responder en un modo distinto a las diversas citoquininas y auxinas a parte debido a su control hormonal natural. Una secuencia apropiada de hormonas es de importancia particular en cuanto que una hormona puede tener un efecto inductor pero debe estar ausente o en cantidad reducida para que crezca el órgano.

2.3. 6.1 FORMACIÓN DE CALLO

Callo: masa de células parenquimáticas, que se desarrolla en una superficie cortada. Ocurre en la unión de un injerto, originandose de las células del vástago y del pie. La producción e interconección de estas células constituye uno de los pasos más importantes en la formación del callo que dará como resultado un injerto exitoso.

Callo: masa de células desdiferenciadas obtenidas a partir de un explanto cultivado in vitro (disco de hoja, meristema, células en suspensión, etc.). Es posible regenerar brotes o vástagos a partir de estos callos.

La composición salina más empleada para inducir la formación de callo, la organogénesis directa o indirecta en la mayoría de las especies vegetales, es la de Murashige & Skoog (1962) (MS). Sin embargo, existen otras formulaciones diseñadas para inducir determinados patrones morfogénicos. Existe, además, una estrecha relación entre la composición hormonal del explante y la concentración de reguladores del crecimiento agregada al medio de cultivo.

2.3.6. CAMBIOS FISIOLÓGICOS DEL EXPLANTE

Puede haber también cambios fisiológicos o sensibilidad, que se expresa como una cambio de comportamiento ocasionado por las condiciones de cultivo; estos cambios ocurren con esterada frecuencia, y son revestidos cuando el cultivo se vuelve a poner en las condiciones originales.

La variabilidad fisiológica en los cultivos de células vegetales es la más fácil de aplicar, debido a la rápida reversibilidad del cambio producido.

Estomas atrofiados, no son funcionales al 100%.

Cutícula más delgada y con aberturas.

Parénquima desorganizado, no están unidas, es decir, es ineficiente.

Con menos luz y azúcar en las plantas se realiza menos fotosíntesis y en gran porcentaje son heterótrofas y en poco porcentaje son autótrofas.

Como tienen mucha humedad relativa las raíces son más delgadas, pocas raíces y no son funcionales.

2.3.5.4 HUMEDAD RELATIVA

La humedad relativa (HR) como medida de la cantidad de vapor de agua contenida en la atmósfera gaseosa, es otro de los parámetros físicos a tener en cuenta. La HR dependerá del sello o cobertura del envase empleado. Si este cierre es hermético, la humedad interior será del 100 %. Si existe la posibilidad de un intercambio gaseoso, la humedad interna puede descender a niveles cercanos al 50 %. Este importante descenso del contenido de HR puede promover una pérdida veloz de agua del medio de cultivo, variando la concentración de sus compuestos hasta llegar a niveles tóxicos.

2.3.5.3 TEMPERATURA

La temperatura de incubación de los cultivos es un factor importante a tener en cuenta. Si bien en las condiciones naturales de cultivo las plantas tienen diferencias térmicas durante el día y la noche, las temperaturas in vitro se mantienen casi estables. Es importante señalar que cuanto más se asemejen las condiciones in vitro a las óptimas de crecimiento de la especie estudiada, mayor será la respuesta esperada. En cultivos de hojas de Streptocarpus x hybridus sometidos a diferentes temperaturas, se observó que la regeneración mayor de brotes se obtuvo a 12 ºC, mientras que por encima de los 30 ºC casi no hubo diferenciación.

La temperatura de la cámara de cultivo viene afectada por: la temperatura ambiente de la sala donde se sitúe y el calor generado por las fuentes de luz de que dispone.

El control de la temperatura a la que se desarrolla el cultivo in vitro se efectúa mediante un sistema de refrigeración-calefacción controlado a través de un termostato.

Para poder caracterizar adecuadamente el funcionamiento respecto de la temperatura de una cámara de cultivo conviene conocer:

La homogeneidad de temperatura: es decir la variación de la temperatura en diferentes zonas de la cámara. Se puede aumentar la homogeneidad haciendo circular el aire dentro de la cámara mediante un sistema de ventilación

La estabilidad de la temperatura: es decir, una medida de la variación de la temperatura de la cámara de cultivo a lo largo del tiempo

Todas las cámaras disponen de un programador que permite regular la temperatura a la que está la cámara en cada momento

2.3.5.2 INTENSIDAD LUMÍNICA

La luz es uno de los factores principales que determinan el desarrollo de los organismos autótrofos, en ello radica la importancia de controlar el factor luz en los cultivos in vitro. Los aspectos aspectos relacionados con la luz que son importantes en los cultivos in vitro son:

La cantidad de luz: LA IRRADIACIÓN. La irradiancia puede ser expresada en función de la energía por unidad de superficie W/m2

La calidad de la luz: EL ESPECTRO (λ) Los tubos fluorescentes son las fuente de luz más usada en las cámaras de cultivo.

La luz suministrada a los cultivos debe ser evaluada en cuanto a la calidad, intensidad y período de suministro. La respuesta morfogénica de un explante puede variar según se le proporcione luz o no. Para estimular la formación de callo es común que se prefiera la oscuridad. El suministro de luz favorece la diferenciación de órganos. Los procesos morfogénicos dependen del genotipo seleccionado, pero, además, debe sumarse el efecto del explante seleccionado. El tratamiento de la planta madre, las condiciones físicas y fisiológicas en las que ésta se encuentre y el sector del cual se tome el explante determinarán a su vez la respuesta morfogénica en condiciones in vitro.

2.3.5.1 FOTOPERIODO

La alternancia de los ciclos de luz con los de oscuridad: EL FOTOPERÍODO. Algunos fenómenos propios del desarrollo de las plantas (germinación, La alternancia de los ciclos de luz con los de oscuridad: EL FOTOPERÍODO. Algunos fenómenos propios del desarrollo de las plantas (germinación, floración, tuberización,...) pueden ser activados por el número de horas diarias de luz que recibe la planta. De forma análoga, el número de horas de luz que recibe el explanto cultivado in vitro puede afectar a su desarrollo. En general, el mejor fotoperiodo in vivo será también el mejor fotoperiodo in vitro. En general se utiliza luz blanca y un fotoperiodo de 16hs de luz y 8 hs de oscuridad.

2.3.5. CONDICIONES DE INCUBACIÓN

Factores relacionados con el ambiente de incubación

· Luz, obscuridad o fotoperiodo

· Tipo de luz

· Temperatura

Como se puede ver el numero de factores implicados en el proceso de organogénesis es muy grande, y el fenómeno en si no se comprende lo suficiente como para manipularlo a partir de una base solida de conocimientos. Los conocimientos básicos que se tienen hasta la fecha provienen en su inmensa mayoría de experimentos de ensayo y error. Debido a esto al trabajar por primera vez con una especie deberán montarse experimentos que nos permitan desarrollar el mejor sistema para regenerar órganos a partir de ese material vegetal.

La incubación de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Por lo menos en lo que se refiere a temperatura, calidad e intensidad de luz, fotoperíodo, humedad atmosférica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cámaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (frío-calor) y una buena y uniforme circulación de aire en el interior y dotados de un buen sistema de alarma para cortar la iluminación en caso de no funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 ºC, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es generalmente provista por lámparas fluorescentes del tipo «luz día» con una irradiancia de entre 50 y 200μmol m-2s-1. La humedad atmosférica debe ser elevada (80- 90%).

2.3.4.3 SIEMBRA DE DIFERENTES MEDIOS: SÓLIDOS Y LÍQUIDOS

Consistencia del medio.

El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido). dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido). En el caso de un medio sólido, la concentración y calidad del ágar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.). El cultivo en medio líquido se utiliza cuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías. El cultivo en medio líquido se utiliza cuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías:

- Inducción de embriogénesis

- Cultivo de protoplastos

- Cultivo de suspensiones celulares

Otro aspecto importante a tener en cuenta es la consistencia del medio de cultivo. Puede emplearse como semisólido o líquido. El agente gelificante más empleado en el cultivo in vitro es el agar extraído de diversas algas marinas. Las diferentes calidades existentes en el mercado modifican la expresión morfogénica debido a que pueden contener sustancias inhibitorias o promotoras del crecimiento. Tal es el caso del cultivo de hojas de Actinidia chinensis, cultivadas en una solución de MS con el agregado de 0,1 mg.L -1 de AIA + 1 mg.L -1 de BAP, donde se observó una respuesta morfogénica diversa según el tipo de agar seleccionado. Por ejemplo, cuando el gelificante empleado fue Chubut-agar, de producción nacional, se observó una gran diferenciación de yemas adventicias, mientras que con el agregado de agar SIGMA R sólo se indujo la proliferación de callo. En caso de seleccionar medios de cultivo líquidos, la respuesta morfogénica observada varía de manera considerable. El cultivo líquido es imprescindible cuando se busca promover la morfogénesis indirecta a través de suspensiones celulares. Para ello es necesario cultivar los callos en medio líquido con agitación para permitir que las células se disgreguen y puedan diferenciar raíces, brotes o embriones somáticos en forma aislada. La selección del medio de cultivo líquido o sólido depende, además, de la especie empleada. En Cymbidium spp, por ejemplo, se ha observado que el empleo de medio de cultivo líquido promueve una mayor diferenciación de protocormos respecto del mismo medio gelificado. A su vez, este proceso puede mantenerse durante varios subcultivos mientras que en medio de cultivo gelificado se observó que los protocormos tienden a formar tallos.

2.3.4.2 DISECCIÓN DEL EXPLANTE

Cultivar los explantes en una cámara de transferencia con aire estéril («gabinete de flujo laminar»), localizada en un ambiente limpio y no expuesta a corrientes de aire. De no disponer este equipamiento, se pueden sustituir con cuartos esterilizados previamente con luz ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV en forma directa). La mesada de trabajo y las paredes del gabinete deben ser desinfectadas previamente con etanol al 70%. De la misma manera deben ser desinfectados exteriormente todos los recipientes (conteniendo medios de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el área del aire estéril. Los operarios constituyen frecuentemente una importante fuente primaria de contaminación, porque es recomendable que, antes de comenzar a trabajar laven sus manos y antebrazos con abundante agua y jabón y se des infecten con etanol al 70 %. La utilización de guardapolvos, guantes y máscaras protectoras de la boca y de la nariz, así como los gorros protectores de los cabellos, ayudan a reducir sensiblemente los niveles de contaminación. Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, tijeras, agujas, cápsulas de Petri) deben ser esterilizados antes de su uso. Muchos de estos instrumentos pueden ser colocados en etanol al 95% y, antes de ser usados, se deben flamear cuidadosamente en la llama de un mechero. También es necesario flamear la boca de los recipientes que contienen los medios de cultivo antes y después de cultivar el explante. Incubar los cultivos en cámaras o cuartos de cultivo, cerrados, libres de corrientes de aire y bien higienizados. En lo posible se debe restringir la circulación de personas, y los recipientes con cultivos contaminados deben ser rápidamente eliminados de este sector. Es conveniente que antes del lavado, estos cultivos sean esterilizados.

2.3.4.1 DESINFECCIÓN DEL EXPLANTE

Realizar una adecuada preparación de la planta dadora de explantes, cultivándola preferentemente en invernaderos tratadas con productos químicos que eliminen patógenos y eventuales microorganismos endófitos.

Los explantos deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo. Protocolo del tipo de esterilización superficial de material vegetal son:

- Lavado con agua corriente durante 20-30min

- Etanol 70%, entre 5 y 10 seg.

- Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) de 5 a 20%, entre 5 y 30 min. Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%. soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2 ), entre el 0,01 y 0,05%.

- Enjuagues con abundante H2O estéril (4 ó 5 veces).

- En el caso del HgCl2 , el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difícil de eliminar.

Lavado inicial con detergente para eliminar las partículas e impurezasmás grandes, seguido de una inmersión en alcohol de 95º; posteriormente unadesinfección inicial con NaOCl más fuerte que la segunda (también en NaOCl), y 3lavados con agua destilada estéril después de cada desinfección con NaOCl paraeliminar los restos de los compuestos químicos. El alcohol de 95º, además de servircomo agente bactericida, se utilizó como surfactante para que los tejidos fueranfácilmente penetrados por los siguientes germicidas (el NaOCl en este caso). Laprimera desinfección con NaOCl se utilizó siempre en mayor concentración que lasegunda, pues el tejido inicial (hojas superficiales del brote lateral entero) requeríauna desinfección sin importar el daño de ese tejido, ya que no era el explante deinterés; además, por tratarse de un brote cerrado, el contacto del alcohol y del NaOClde la primera desinfección difícilmente alcanzó el meristemo apical. La segundadesinfección con NaOCl se utilizó siempre en menor concentración respecto de la primera, pues ya para el momento de su realización, se habían eliminado algunas hojas.

2.3.4. SIEMBRA DEL EXPLANTE

Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas (explante) dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. Esto se realiza haciendo uso de una pinza esteril para evitar toda contaminación por microorganismos: hongos, bacterias, virus, esporas.

En un período de una semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

Es importante conservar la polaridad de la planta madre. Segmentos de tallos y yemas deben ser colocados en el medio con la polaridad adecuada.

2.3.3.3 TAMAÑO DEL EXPLANTE

Entre más grande sea el explante mayores serán las posibilidades de inducir la proliferación de callos o la regeneración directa de órganos. Sin embargo, a mayor tamaño de explante también son mayores las probabilidades de que los cultivos sean contaminados con microorganismos

2.3.3.2 POSICIÓN DEL EXPLANTE EN LA PLANTA

Los explantes se colocaron en cajas Petri de 12 x 100 mm con 20 mL de medio de cultivo esterilizado. Se aplicaron seis tratamientos a cada genotipo, resultado de la combinación de los dos tipos de explantes y los tres medios de cultivo. Cada tratamiento tuvo quince repeticiones, y un explante representó una repetición. Los explantes se incubaron en oscuridad total a 26 °C y 50 % de humedad relativa.
Las variables de respuesta para este experimento fueron: porcentaje de explantes con capacidad de respuesta morfogénica, expresada en crecimiento de los bordes del explante; porcentaje de explantes con callogénesis; y porcentaje de explantes con callo embriogénico, esta última detectada con base en la presencia de embriones en diferentes estados de desarrollo (fase globular, acorazonado, torpedo y cotiledonar), en una muestra de 0.83 g de callo. La evaluación de las variables se llevó a cabo a los 60 d del establecimiento in vitro.

2.3.3.1 TIPO DE EXPLANTE

Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas (Fossard 1999). El tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagación depende de la especie con la que se esté trabajando y de los objetivos que se persigan. Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el cultivo. Otros explantes como las yemas adventicias son mas bien genéticamente inestables y producen un alto grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es útil para la producción de plántulas con una determinada característica de cultivo, pero si lo es para el fitomejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de cultivo.
Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante (Fontúrbel 2001) y compiten con el mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo (Kyte & Kleyn 1996).

Los explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un medio de cultivo apropiado (Kyte & Kleyn 1996) al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que el explante está en el medio, se sella el rasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo.

Una vez que los explantes –luego de algunas semanas en la cámara de crecimiento– han desarrollado algunas raíces y hojas, es el momento de realizar el traspaso al invernadero. Este es uno de los pasos más difíciles de la técnica, ya que los explantes in vitro se encuentran en condiciones ambientales muy diferentes y se alimentan de manera heterotrófica (del medio de cultivo) y el estrés de adaptación a las condiciones de vivero es muy fuerte (Kyte & Kleyn 1996, Fossard 1999). Un porcentaje de las plántulas clonadas in vitro no sobrevive al invernadero, pero la parte que si sobrevive crece –ya en condiciones normales– y al cabo de una semanas está lista para ser trasladada al campo de cultivo.

2.3.3. EXPLANTE

Explante se refiere a cualquier parte vegetal que ha sido separada de la planta, que puede ser un tejido (fragmentos de hojas, tallos, raíces, pétalos, etc.), un órgano (semillas, anteras, ovarios, botones florales, hojas y raíces completas, etc.), estructuras como las anteras y los ovarios, o bien células individuales. Con excepción de los óvulos y el polen, los explantes están constituidos por tejidos y/o células somáticos.

El nombre “explante” es una versión castellanizada del vocablo inglés “explante”; acuñado especialmente para identificar a los tejidos vegetales cultivados in vitro y sin otro significado. La selección del explante es un aspecto clave para tener éxito en el cultivo de tejidos, ya que dependiendo de su ubicación en la planta, del tipo de tejido que contiene, de su edad cronológica y fisiológica, de su contenido endógeno de hormonas, entre otros, se comportará de una manera o de otra

2.3.2.5 EDAD DEL ÓRGANO O TEJIDO VEGETAL

Edad del órgano de la planta desde que ha sido extraída de su medio: edad biológica de la planta tiempo que ha transcurrido desde que la planta comenzó como retoño.

2.3.2.4 CONDICIONES DE CRECIMIENTO DE LA PLANTA

Las plantas no son capaces de mantener su temperatura constante por lo que los cambios de temperatura ambiental influyen sobre su crecimiento y desarrollo, son poiquilotermas, pero esto no significa que su temperatura sea igual que la del ambiente, pueden haber diferencias. Lo que sí es cierto es que las variaciones de temperatura ambiental originan variaciones en la temperatura de la planta. Las variaciones de la temperatura ambiental son periódicas, diarias (día/noche) y estacionales, también se dan variaciones fluctuantes +/- previsibles como la variación de temperatura por nubosidad, variaciones dependientes de la posición de la hoja en la planta, las hojas tapadas por otras hojas tendrán menos temperatura, también depende de la velocidad del viento, altura de la hoja así como la forma de hoja. Además, la temperatura de la raíz no tiene porque ser igual a la temperatura de la parte aérea ya que las variaciones de temperatura llegan a la raíz con retardo respecto a las de la parte aérea. El régimen térmico dentro del vegetal es complejo ya que se dan variaciones de temperatura en las diferentes plantas. En el campo no se pueden realizar estudios y en el laboratorio es complicado reproducir las condiciones ambientales, por lo que no hay buenos estudios. Los diferentes procesos fisiológicos tienen diferentes temperaturas óptimas y tambien especies diferentes tienen diferentes temperaturas óptimas. Normalmente, para un proceso utilizamos:

temperatura óptima.

temperatura cardinal.

temperatura crítica.

La temperatura óptima se da cuando el proceso se realiza con la máxima eficiencia:

La temperatura cardinal es la temperatura por encima ó por debajo de la cual un proceso fisiológico se para, volviendo a funcionar cuando la temperatura está por encima de la mínima cardinal ó por debajo de la máxima cardinal.

La temperatura crítica son las temperaturas por debajo ó por encima de las cuales un proceso fisiológico sufre daños irreversibles y la planta muere. Estas dos temperaturas críticas (mín y máx) no son constantes durante la vida de la planta, sinó que pueden variar durante el desarrollo, así, una planta en pleno crecimiento vegetativo tiene una temperatura crítica + alta que una que esté en dormición.

2.3.2.3 EDAD DE LA PLANTA

Gran parte del éxito de cultivo de tejidos, esta en la edad del explante que va a ser utilizado para los trabajos. La edad de la planta y el grado de diferenciación del tejido, muchas veces son están interrelacionados, y pueden producir efectos interactivos cundo se cultiva in vitro.

Por ejemplo, según los experimentos realizados por Toivonen ty Kartha, en 1988, quienes trabajaron con Pinus glauca, descubrieron que las plantulas a las que se les extirpo los cotiledones 7 a 8 días luego de ser plantadas, formaban las primeras yemas adventicias antes que plantulas cuyas yemas fueron extirpadas luego de los 8 días. Así también la producción de yemas adventicias en explantes de hojas de Cucumis melo, mostraron mayor producción en los explantes que tenian un a tamaño entre 0.3 y 0.5mm los cuales tenían 14 días de plantados. Esta propiedad no tenían aquellos explantes que tenían mas de 21 días.

La edad del explante pude clasificarse en cuatro clases:

« Edad del órgano o de la planta desde que ha sido extraída: Es la edad biológica de la planta, es el tiempo que ha transcurrido desde que la planta comenzó como retoño o como embrión.

« Edad fisiológica o ontogenética: O fase de crecimiento. Incluye los conceptos de juvenilidad y adulto.

« El grado de diferenciación: Con este concepto, las partes mas jóvenes de la planta son células meristemáticas no diferenciadas. Teóricamente se dice que algunas plantas poseen las células meristematicas siempre en estado juvenil y que podrían vivir para siempre.

« Periodo de cultivo: Es el tiempo desde que recién se instala el cultivo.

Factor importante ya que los tejidos juveniles poseen un alto grado de actividad meristematica y tienden a tener más plasticidad in vitro que los adultos.

Los tejidos juveniles presentan una mayor capacidad morfogenetica, la cual se manifiesta en respuesta de crecimiento, proliferación y enraizamiento, a diferencia de un tejido maduro el cual es más difícil de desdiferenciar e inducir a la producción de raíces y brotes.

Órganos jóvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos. El empleo de explantes que se encuentran expuestos a bajos niveles de patógenos puede resolver el problema de la contaminación por hongos y bacterias durante el establecimiento del cultivo in vitro.

2.3.2.2 FITOSANIDAD

La contaminación microbiana es uno de los problemas más graves en la micropropagación de especies vegetales a nivel mundial, produce cuantiosas pérdidas de material, tanto en los trabajos de investigación como en la micropropagación comercial. Puede tener dos orígenes: a) microorganismos que colonizan la superficie o el interior del explante (endófitos) y b) microorganismos introducidos durante la manipulación en el laboratorio. Los contaminantes más frecuentes en condiciones in vitro son los hongos, las bacterias y levaduras, denominados "vitropatógenos", aunque también existen otros menos frecuentes como los virus, viroides y microartrópodos (ácaros y trips). El término vitropatógeno ha sido usado para aquellos organismos que no son necesariamente patógenos para las plantas en el campo, pero sí son perjudiciales para células, tejidos u órganos cultivados in vitro, mientras que el término patógeno ha sido confinado para describir a un organismo que causa enfermedad a las plantas cultivadas en el campo. Se ha sugerido que los vitropatógenos pueden ser dañinos para el cultivo de tejidos vegetales, ya que compiten con el explante por los nutrientes del medio y les producen daños directos e indirectos por la colonización de sus tejidos o liberación al medio de metabolitos tóxicos, aunque en la actualidad no se encuentran muchos trabajos en la literatura científica que expliquen el mecanismo de acción de los contaminantes, que los hacen perjudiciales para las plantas in vitro.

2.3.2.1GENOTIPO

El genotipo es la totalidad de la información genética que posee un organismo en particular, en forma de ADN. Junto con la variación ambiental que influye sobre el individuo, codifica su fenotipo. De otro modo, el genotipo puede definirse como el conjunto de genes de un organismo y el fenotipo como el conjunto de rasgos de un organismo. Por tanto, los científicos y los médicos hablan a veces por ejemplo del genotipo de un cáncer particular, separando así la enfermedad del enfermo. Aunque pueden cambiar los codones para distintos aminoácidos por una mutación aleatoria (cambiando la secuencia que codifica un gen, eso no altera necesariamente el fenotipo). Se le llama genotipo a toda la dotación genética. Hay 23 pares de cromosomas en la especie humana, en total 46. La ordenación recibe el nombre de cariotipo.

La influencia del genotipo es un factor importante para lograr la regeneración de plantas haploides o dobles haploides (diploides) que pueden ser de utilidad en programas de mejoramiento

2.3.2. SELECCIÓN DE PLANTAS MADRES

El éxito de la técnica depende de muchos factores, entre ellos la edad de la planta (a mayor edad, menor potencial de regeneración), el genotipo y las condiciones ambientales.

Entre las ventajas del cultivo in vitro de material vegetal, se pueden incluir los tiempos más cortos, y la posibilidad de ocupar un espacio mucho más pequeño que si se desea propagar material en tierra

Para establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.

2.3.1.4 ADAPTACIÓN

Adaptación o Rusticación, que es la aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones ambientales ex vitro (suelo o algún sustrato inerte)

Proceso fisiológico o rasgo morfológico o del comportamiento de características que incrementan la supervivencia y/o el éxito reproductivo

La adaptación es un proceso normalmente muy lento, que tiene lugar durante cientos de generaciones y que en general no es reversible.

Esta fase consiste en el paso de las plantas del cultivo al medio natural. Este es un paso extremadamente importante, ya que si no se realiza cuidadosamente se pueden perder gran número de plantas. Las plantas en condiciones de cultivo están en una atmósfera con alta humedad y baja intensidad luminosa, por tanto el tejido epitelial se caracterizará por tener menos ceras que protejan a las plantas contra la deshidratación. El acondicionamiento de nuevo al medio exterior se efectuará por tanto cuidadosamente, utililizando para ello invernaderos.

2.3.1.3 ENRAIZAMIENTO

Antes de llevar las nuevas plantas al exterior es necesario proporcionarles una raíz con la que sean capaces de realizar sus actividades vitales una vez que se encuentren de nuevo en el medio natural. La inducción de estas raíces se produce modificando ligeramente las características del medio de cultivo adecuándolas para la generación de raíces.

Enraizamiento, en la que se busca la formación de raíces con el fin de convertir los brotes o embriones somáticos en plántulas completas.

Antes de extraer los explantes se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los más comunes son los hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia. A efectos de obtener las condiciones de asepsia, se trabajará en cabinas de flujo laminar para extraer los explantes a partir del material vegetal. Estos explantes se introducirán en un tubo de cultivo conteniendo medio de iniciación para poder controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizar la desinfección del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluída durante un período de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada.

2.3.1.2 MULTIPLICACIÓN

Multiplicación, para generar una masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.

Se excluirán no sólo las partes que presenten lesiones, aunque sean ligeras, pues las mismas podrían ser de naturaleza parasitaria o infecciosa, sino también los órganos de apariencia sana pertenecientes a plantas afectadas por enfermedades criptográmicas o virosas susceptibles de existir ya en el interior de las células y de manifestarse en un periodo relativamente corto.

Una vez que la primera fase se ha completado con éxito, comienza la multiplicación de los explantos. El explanto encuentra en el medio de cultivo todo aquello que necesita para su crecimiento y desarrollo (agua, elementos minerales, azúcares, hormonas, etc). Tras un período de crecimiento (4-8 semanas) es necesario el subcultivo y paso a un nuevo medio. Es en este paso donde se produce la multiplicación de las plantas.

2.3.1.1 ESTABLECIMIENTO ASÉPTICO

Establecimiento, que consiste en la desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático según se desee.

El cultivo de tejidos comienza a partir de trozos extraídos de la planta madre. Estos pequeños órganos o trozos de tejido se llaman explantos. Las plantas que crecen en el medio natural están contaminadas por microorganismos (bacterias y hongos). Los explantos antes de ser introducidos en el medio de cultivo han de ser esterilizados. Posteriormente se introducirán en el medio a su vez estéril y se mantendrán allí en condiciones asépticas.